一种变换核酸基因型的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体设及医学诊断和生物技术。
【背景技术】
[0002] 选择性扩增核酸和选择性破坏核酸，在核酸分析领域已有许多成功的应用例 证。一个选择性扩增核酸的最有价值的例子是聚合酶链式反应（Polymerase化ain Reaction,PCR)。PCR因其应用十分广泛，已获诺贝尔奖。另一个选择性扩增核酸的例子是 采用一定比例的双脱氧单核甘酸介导的部分链终止法核酸扩增，也即Sanger'S经典测序 技术，该技术也已获诺贝尔奖。
[0003] 两个选择性破坏核酸的例子为采用识别核酸不同碱基的化学试剂对核酸进行部 分降解，运是世界上最早出现的实用测序技术即化学裂解法测序，也已获诺贝尔奖。另一例 子为核糖核酸酶保护分析用于核糖核酸的定性与定量分析。
[0004] 核糖核酸酶保护法主要用于实验研究，该方法可用W从细胞中提取出来混杂的 RNA样本中鉴定出单独的RNA或多种RNA。此技术可W在即使总浓度很低的情况下鉴定一 种或多种已知序列的RNA分子。被提取出来的RNA首先与反义RNA或DNA探针相混合，探 针是与被研究的序列相互补的，接下来互补链相互杂交W形成双链RNA(或DNA-RNA杂交分 子）。然后将混合物使用具有特异性地切割仅为单链的RNA的核糖核酸酶，而不对双链核酸 分子发挥酶解作用。当反应进行完全时，易受影响的RNA区域被降解为非常短的低聚物或 单个核巧酸；存留下来的RNA片段是与之前所加进的反义链相互补的RNA，因此包含目的序 列。获得保护的目的序列片段通过后续电泳或其他分析技术得W确认。但是，核糖酶保护 分析法只应用了选择性破坏核酸，而未同时采用选择性扩增核酸。 阳0化]上述例证都为单独应用选择性扩增核酸或选择性破坏核酸。但上述例子中的单独 反应，在同时含有不同等位基因或野生序列片段和突变片段的混合标本，尤其是当混合标 本中的大多数基因片段均为非目的片段而其中稀有的基因型为目的片段时，如何通过技术 手段得到较高含量的稀有基因型产物，是常规基因扩增技术难W满足的难点。
[0006] 而现实世界的许多生物标本，如尿液提取的游离核酸，粪便提取的游离核酸，血液 提取的游离核酸，W及动植物的组织核酸提出物等，在用于基因克隆或基因突变分析时的 难点是在大多数情况下，是特定目的基因型片段较少，或野生序列片段含量高而突变序列 含量过低，W及特定基因片段较短等。一种有用的技术方案为首先对目的基因型片段进行 富集。BEAMing技术平台即采用先富集突变序列然后再对其进行分析的技术路线。其存在 的缺陷是：（1)富集效率较低；(2)此外，富集需要针对变化多样的不同种可能的突变序列； (3)富集难W对基因组数量巨大的突变序列设计和生产相应的富集材料。尽管PCR结合测 序分析存在假阳性，但仍具有高敏感性，临床上得到较广泛应用。但是，当突变片段较设 计的引物对包含的范围更段时，PCR不能扩增突变片段，从而测序也无法得到突变片段的 信息。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种可W在混合有不同等位基因或混合有野生 与突变基因片段的生物标本中选择性提高目的基因型基因片段的方法。通过破坏特定基因 型对应的基因序列，利用DNA聚合酶对上述基因被破坏过程所产生的部分可延伸断裂片段 进行延伸反应。延伸反应的产物中已转换基因型的部分在下一次反应中作为模板使用，而 未转化基因型的部分产物将被基因破坏反应所破坏。
[0008] 为了解决上述的技术问题，本发明提供的技术方案为：
[0009] 一种体外变换核酸基因型的方法，其包含如下步骤：
[0010] (1)提供含有不同等位基因型的混合标本，其包括目的基因型核酸片段和特定基 因型核酸片段；
[0011] (2)对其中一种特定基因型核酸片段进行选择性破坏；
[0012] (3)利用被选择性破坏后的断裂片段W其他等位基因的目的基因型核酸片段作为 模板进行核酸延伸反应；
[0013] 后面两个反应步骤按照顺序重复进行25-55次。
[0014] 本发明一优选技术方案，特定基因型的核酸片段被选择性破坏后，产生的断裂片 段有两种情形：(A)断裂片段Ξ末端具有与目的基因型核酸片段不配对的碱基，度）断裂片 段Ξ末端不具有与目的基因型核酸片段不配对的碱基。此时，断裂片段上与目的基因型核 酸不配对的碱基位于断裂片段的五末端。
[0015] 本发明一优选技术方案，核酸延伸反应为采用DNA聚合酶介导的化学反应。
[0016] 作为本发明一优选技术方案，当断裂片段为情况（A)时，采用的DNA聚合酶为具有 Ξ末端向五末端外切功能的高保真DNA聚合酶。当断裂片段为情况度）时，采用的DNA聚 合酶为不具有Ξ末端向五末端外切功能的DNA聚合酶。
[0017] 本发明一优选技术方案，选择性破坏核酸等位基因型为核酸酶介导的具有破坏特 定序列的化学反应。
[0018] 优选地，核酸酶选自天然的限制性核酸内切酶，或者是基因工程核酸酶，包括但不 限于CRISPR-cas9核酸酶，锋指核酸酶狂FNs)，反因子核酸酶灯ALE化）中的任意一种。且 上述的核酸酶优选耐高溫，具体而言例如，耐受95°C的高溫而不失活。
[0019] 本发明的优选技术方案之一，所述化学反应是具有破坏核酸特定序列的非生物酶 类的化学试剂介导的化学反应。
[0020] 本发明一优选技术方案中，其包含步骤如下：提供含有不同等位基因型的混合标 本，其包括目的基因型核酸片段和特定基因型核酸片段；目的基因型样本片段通常为突变 型基因型核酸片段；该特定基因型核酸片段通常为野生型基因型核酸片段；
[0021] 在上述的混合样本中，加入对其中特定基因型核酸片段进行选择性破坏的耐高溫 核酸酶；
[0022] 在上述混合样本中加入可扩增目的基因型核酸片段的引物和DNA聚合酶进行PCR 反应。
[002引在本发明的方法中，还可W在上述PCR反应体系中加入包含有目的基因型核酸片 段的突变碱基的寡核巧酸单链。且加入的含有突变碱基的寡核巧酸单链，可W为正向突变 碱基的寡核巧酸单链和/或反向突变碱基的寡核巧酸单链。
[0024] 本发明方法中，耐高溫核酸酶为可W耐受95°C的高溫而不失活的核酸内切酶，例 如耐高溫核酸内切酶PstI，化elll。
[00巧]本发明的方法可用于核酸定性和定量分析。
[00%] 本发明的技术核屯、为将核酸破坏技术与DNA聚合酶对断裂的核酸片段进行延伸 技术相偶联，达到基因型变换的效果。
[0027] 通常，高保真聚合酶的产物表现出模板依赖性，而低保真聚合酶表现出引物依赖 性。本发明中采用的选择性破坏特定基因型基因序列片段的反应，为目的基因型在作为模 板获得模板依赖性延伸产物的反应中逐渐成为混合标本中的主要成分，达到基因型体外变 换的目的。当不同基因型表现为断裂片段五末端与不会被破坏的基因型片段不完全相同 时，使用低保真聚合酶对断裂片段进行延伸，已变换基因型的延伸产物在随后的破坏反应 中不被破坏而再次作为目的基因型模板；未变换基因型的延伸产物在随后的破坏反应中被 破坏。当不同基因型表现为断裂片段Ξ末端与不会被破坏的基因型片段不完全相同时，使 用高保真聚合酶对断裂片段进行延伸，该聚合酶利用其校正功能先对断裂片段Ξ末端进行 校正，然后进行模板依赖性延伸，使被破坏的基因型产物变换为目的基因型产物。
[0028] 选择性破坏核酸是生物领域常用技术，如一些核糖核酸酶可选择性破坏核糖核 酸而不破坏脱氧核糖核酸，反之亦然，一些脱氧核酸酶选择性破坏脱氧核糖核酸而不破坏 核糖核酸；一些限制性核酸内切酶还能仅仅破坏具有特定序列的核酸，而对其他核酸序列 没有破坏作用。具有对特定序列选择性破坏的核酸酶包含限制性核酸内切酶，锋指核酸 酉每（zincfingernuclease)，反因子核酉《酉每（Transcriptionactivator-likeeffector nuclease)， 和CRISPR-cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromic r巧eatsequences-cas9)系统等。除上述蛋白质酶类外，核糖核酸本身也可作为一种核酸 酶，破坏特定核酸，该发现在多年前已获诺贝尔奖。一些化学试剂，除前面提到的已得到诺 贝尔奖的化学测序法中对单个核酸相关憐脂键具有破坏作用的化学试剂外，飽-邸TA与肤 核巧酸结合能对特定序列脱氧核糖核酸进行破坏。
[0029] 本发明中含有不同等位基因片段的样本，是指样本中包括控制某一性状的不同种 类的基因类型，例如可W是指突变型与野生型的混合标本，突变型基因型核酸片段为目的 基因型样本片段；野生型基因型核酸片段为待破坏的特定基因型核酸片段。
[0030] 本发明上述的混合样本中，加入的耐高溫核酸酶可W对待破坏的基因型核酸片段 进行选择性破坏，耐高溫核酸酶优选为耐高溫限制性核酸内切酶，可W耐受95°c的高溫而 不失活。野生型基因型核酸片段含有耐高溫限制性核酸内切酶的酶切位点，而与之相对的 突变型基因型核酸片段由于碱基发生突变，在其相应的位点则无法被酶切。在一些实施例 中，碱基突变点处为某些核酸内切酶的酶切位点，则可W直接添加相应的酶进行PCR反应， 进行基因型变换。在另一些