C解 育15分钟。
[0039] C.向该细胞裂解物中加入SyLRNA酶溶液，颠倒离屯、管2-5次混匀，37°C解育15 分钟，室溫冷却5分钟后再进行下一步操作。
[0040]d.加入200μL蛋白沉淀液，并使用满旋振荡器高速剧烈振荡20秒钟。
[0041]e. 13,ΟΟΟχg离屯、3分钟，移取上清（含DNA)至一装有600μL异丙醇的1. 5血小 离屯、管中，弃蛋白沉淀。
[0042]f.轻轻颠倒混匀溶液，直至白色线状DNA形成块状沉淀。
[0043] g.13,OOOxg室溫离屯、1分钟，弃去上清，加入70 %乙醇600μL轻轻颠倒离屯、管 数次，清洗DNA沉淀，13,ΟΟΟχg室溫离屯、1分钟，使用移液器枪头吸走乙醇溶液。
[0044] h..将离屯、管倒置在干净的吸水纸上，自然干燥15分钟。
[0045]i.向离屯、管中加入 100μLDNARehy化ationSolution，65°C解育 1 小时溶解DNA。 期间可轻弹管壁混匀溶液。也可4°C解育过夜。
[004引j.2-8°C保存DNA备用。
[0047] 2.引物设计与PCR扩增
[004引（1)引物设计与合成
[0049] 根据玉米基因组序列信息获得玉米薦糖转运蛋白基因ZmSUT4转录起始位点上游 2500bp左右的序列信息，利用Genomatix软件进行核屯、启动子的预测，根据预测启动子序 列设计扩增引物，序列如下：
[0050]ZmS4pFw:5'TGGGCAGGGGCTCACCGGGGTAGGG3'；
[0051]ZmS4pRev:5'TTCCGGAGGGGCACCTTCCGCGGCG3' 〇
[0052]引物购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
[0053] (2) PCR扩增
[0054] W玉米B73基因组DNA为模板，在高保真的LA化q酶（购自TAKARA)的作用下，利 用引物ZmS4pFw和ZmS4pRev进行PCR扩增。
[00巧]反应体系为50 μL由下列成分组成：TaKaRaLATaq(5U/ μL)0. 5 μL 10礼ATaq缓 冲液II(Mg2+plus)5μL，预混dNTP(2.5mMeach)8μL，模版DNA5μL(200ng)，ZmS4pFw 0.4μL ZmS4pRev 0.4μL用灭菌蒸馈水稀释至50 μL。
[0056]扩增条件为：98°C预变性 5min;接着98°C，15s，53°C，30s，72°C，Imin进行 35 个循 环；最后72°C继续延伸lOmin。1.0%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，扩增结果见图1，目的 片段在1. 0化左右。
[0057] 做扩增片段胶回收、连接、测序及分析
[0058] 将得到的PCR产物克隆到地ACKZero-T载体中，白色克隆经PCR检测插入片段大 小符合预期长度，进行测序分析。测序结果表明上述PCR扩增得到的核巧酸序列共96化P， 位于玉米3号染色体的薦糖转运蛋白基因ZmSUT4的上游，将该序列表中的SEQ ID No. 1所 示核巧酸序列的核酸序列命名为ZmSUT4pro启动子狂mSUT4pro)。
[0059] 也可通过人工合成来制备具有序列表中SEQIDNo.1所示核巧酸序列的核酸片 段。
[0060]利用PlantCARE软件化t1:p://bioinformatics, psb. ugent. be/webtools/ plantcare/html)在线分析对所克隆的启动子片段进行顺式元件分析。分析结果见下表：
[0061]
[0062]
[0063]
[0064] 结果表明该启动子除含有启动子的基础转录元件TATA-Box和CAAT-Box外，同时 还含有大量与激素应答相关、胁迫应答相关（生物胁迫与非生物胁迫）、光响应相关、发育 相关和组织特异性相关的顺式作用元件，暗示该启动子在激素、胁迫等条件下可W调控基 因。
[0065] 实施例2植物表达载体的构建与转化
[0066] 1.重组表达载体pCAM-ZmSUT4p-GUS的构建
[0067] 利用PCR扩增方法将ZmSUT4pro的两端分别填加HindllI和BamHI酶切位点，所 用引物序列如下：
[0068]ZmSUT4pH-FW:
[0069] 5'CCCAAGCTTGGGCTCACCGGGGTAGGGCTTCTT3'；
[0070]ZmSUT4pB-Rev:
[0071] 5'CGGGATCCCGGGCGCCTAGCACATCATCGA3' 。
[007引弓I物购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司
[0073]W重组的含有ZmSUT4pro的质粒DNA为模板，在高保真的LATaq酶的作用下进行 PCR扩增，扩增引物为ZmSUT4pH-FW和ZmSUT4pB-Rev，PCR反应体系与扩增条件同实施例 1，扩增产物与地ACKZER0-T载体（购自TaKARA公司）连接，所得白色克隆经PCR检测，选 择阳性克隆进行测序分析，提取所克隆ZmSUT4启动子序列正确的质粒DNA。使用化ndIII 和BamHI限制性内切酶同时酶切重组质粒，1 %琼脂糖凝胶电泳，回收ZmSUT4启动子片段。 同样用化ndIII和BamHI限制性内切酶同时酶切pCAM-UGN(申请人自主构建的植物表 达载体，骨架是商用的PCAMBIA3300,含有玉米的化iquitin启动子，驱动GUS报告基因表 达）质粒载体，并回收载体片段。将ZmSUT4启动子片段与pCAM-UGN载体片段进行连接，重 组质粒命名为pCAM-ZmSUT4p-GUS，其结构示意图见图2,将其转化到农杆菌EHA105菌种中。
[0074] 2.转ZmSUT4启动子烟草植株的获得
[00巧]本生烟草种子若干放在1. 5毫升离屯、管中，加入1ml95 %乙醇灭菌处理6min，将 乙醇吸出用无菌水清洗6次，然后均匀撒在烟草种子培养基MS0上，4°C放置2天后，转入正 常生长条件26°C，昼夜16h/化生长7天，长至有两片真叶的植株即可侵染。
[0076]将含有pCAM-ZmSUT4p-GUS载体的农杆菌EHA105菌液划线于YEP固体培养基（利 福平25μg/ml，卡那霉素100μg/ml)，28°C暗培养2d，取单菌落划线于YEP固体培养基（利 福平25μg/ml，卡那霉素100μg/ml)，20°C暗培养3d，直至菌斑长出。一般情况下，一板划 五条线。刮两到；条菌重悬于20ml侵染培养基，培养基中含有100μΜ乙酷下香酬，将20ml 侵染培养基等分成二份分别放入容积量为100ml的Ξ角瓶中，调节OD值至0. 3-0. 4,23度 100巧m振荡培养2-4h后开始侵染。
[0077] 在铺有滤纸的无菌培养皿上将刚萌发的小植株切成左右的小段，叶片一 定要切出伤口。将外植体放到空皿上加菌液10ml，侵染lOmin(每隔2分钟混匀1次）。将 菌液倒掉取出外植体放在无菌滤纸上吸干，将外植体均匀铺在含滤纸的共培养基上，培养 室暗培养3天后转入筛选培养基进行筛选，2-3周后继代培养直至抗性小苗产生，将抗性小 苗转入生根培养基中，待植株长出根系可W将其移栽到花盆中到3-5片真叶时进行PCR检 测。
[0078] 3.转ZmSUT4启动子玉米植株的获得
[0079] 采用芽尖转化法，用于ZmSUT4p功能快速验证，具体操作步骤：
[0080] 吉853自交系种子经70%酒精lOmin，0. 1%化ClzGmin表面消毒，无菌水洗4-5 遍。无菌水浸泡化后，0. 1%化ClzlOmin，彻底洗净后转到铺有两层湿润滤纸的培养皿中黑 暗条件下萌发，溫度26°C。约Ξ天后将萌发种子转移到固体培养基上（M巧，在黑暗下继续 生长，至胚芽銷长至5-6畑1。
[0081] 在洁净工作台上切除无菌黄化苗多余胚根和侧根，剥去黄化苗芽銷及幼叶，裸露 茎尖生长点用于农杆菌感染。
[008引将带有pCAM-ZmSUT4p-GUS双元载体（Mini-Ti质粒带有Basta抗性基因bar)的根 瘤农杆菌EHA105在附加抗生素的YEP培养基中28°C下震荡