显示的主峰为23. 3kDa大小，运与估计的分子量值一致。另外，观察到的小峰似乎是翻 译后修饰（例如糖基化）的结果。
[0197] 此外，使用TSKgelG3000SWxl柱灯osohCo.)通过尺寸排阻色谱法（SEC)分析本 发明抗体HF2-8的聚集状态（即，可溶聚集体，一种类型的杂质），并且在图6中示出结果。 通过用lOOmM憐酸盐缓冲液（P册.6)作为移动相的等度洗脱来分离，并在280nm监测，观察 到单体峰面积为总峰面积的98%或W上，然而聚集体所占的峰面积小于2%，表明高的纯 度。
[019引实施例10.与人VEGF或小鼠VEGF结合的抗体的分析
[0199] 使用ELISA方法来验证本发明抗体（HF2-1至HF2-26)与人血管内皮生长因子 (VEG巧的结合特性。
[0200] 将稀释在150μL缓冲液中的1. 5ng人VEGF置于96孔免疫板（Nunc,美国）中，并 在4°C吸附过夜，随后用含有0. 1 %Tween20的缓冲液洗涂3次。然后将它们与含有1 %牛 血清白蛋白（Sigma,美国）的缓冲液在室溫下反应1小时，并洗涂3次。然后将每个孔用 150μL系列稀释的抗体（Ing/mL、10ng/mL、30ng/mL、lOOng/mL、lOOOng/mL和 3000ng/mL)处 理。允许它们在室溫下反应1小时，W使得抗原可与抗体结合，随后用缓冲液洗涂3次。
[0201] 用1 : 20000稀释的抗人免疫球蛋白Fc-HRP抗体（AbSerotec，美国）W150μL/ 孔处理每个孔，并允许在室溫下反应1小时。在反应完成后，用缓冲液进行3次洗涂，随后 添加150μL的ΤΜΒ(Sigma,美国）并显色10分钟。用1Ν的硫酸溶液终止该反应，并使用分 光光度计（MolecularDevice,美国）在450皿测量吸光度。结果在图7中示出。将阿瓦斯 汀用作对照组，W相同方式测量其吸光度。
[0202] 如图7所示，确认HF克隆化）（其是克隆F(a)的人源化克隆）的结合特性通过亲 和力改进过程而提高。发现相比于阿瓦斯汀，运些HF克隆（HF2-1至HF2-26)的大多数显 示出对VEGF更高的结合特性。
[0203] 通过ELISAW上文所述的相同方式验证抗体对小鼠VEGF的结合特性。在图8中 示出的结果表明，与阿瓦斯汀不同，本发明的抗体HF2-1、HF2-5、HF2-8和HF2-9结合小鼠 VEGFW及人VEGF，表明本发明的抗体适用于使用小鼠的临床前研究。
[0204] 实施例11.确认本发明抗体对VEGF诱导之HUVEC增殖的阻抑活性
[0205] 确认本发明抗体对VEGF诱导之HUVEC增殖的阻抑活性。
[0206] 通过离屯、人厮静脉内皮细胞（HUVEC，Clonetics，美国）获得沉淀，然后将其在不 包含生长因子和牛血清的邸M-2基础培养基（Clonetics，美国）中悬浮。将细胞悬浮液铺 板到96孔细胞培养板上（每孔的细胞数目相同），将其在恒溫加湿培养箱中解育24小时。 解育完成后，弃掉培养基，并用W系列浓度（30ng/mL、60ng/mL、lOOng/mL、150ng/mL、200ng/ 血、300ng/mL、1000ng/mL和3000ng/mL)稀释的各个抗体与W30~90ng/mL的某浓度稀释 的人VEGF的混合溶液处理孔。将用抗原和抗体处理的细胞在恒溫加湿培养箱中培养4天， 然后用刃天青溶液（Invitrogen，美国）W每孔ΙΟμΙ处理。3~4小时后，在530nm/590皿 测量巧光。使用阿瓦斯汀作为对照，并且相对于仅用VEGF处理的孔的巧光值定量抗体对细 胞增殖的阻抑作用。在图9(b)中示出了当用抗体HF-l、HF-4、HF-5和HF-8处理时，HUVEC 增殖速率的结果，而图9(c)和（d)中示出了用抗体HF-1至HF-5、HF-9和HF-11处理时，细 胞存活率的结果。
[0207] 如图9中所示，本发明的抗体HF2-5阻抑VEGF诱导的HUVEC增殖，程度上类似于 阿瓦斯汀（图9(b)和（d))。另外，示出通过F克隆的人源化（a)和亲和力改进化、C、d) 提高了抗体的活性。
[020引实施例12.确认本发明抗体对VEGF诱导的HUVEC渗透性的阻抑活性
[0209] 评估本发明抗体对VEGF诱导的HUVEC(Clonetics，美国）渗透性的阻抑活性。
[0210] 测试前一天，用胶原蛋白溶液（Sigma,美国）处理具有0.4 μπι微多孔膜的 化answell(皇巧.么舊坤i)W促进细胞附着。使用膜蛋白酶收集细胞，并W5X104细 胞/mL的浓度悬浮。将Transwell中的胶原蛋白溶液弃掉，并用缓冲溶液洗涂Transwell一次。将lOOul的细胞悬浮液分散到每个孔中。向底室添加600μL体积的EGM-2培养基 (Clonetics，美国）。形成单层内皮细胞后，将含有稀释的抗体（HF2-5、HF2-9、HF2-11或阿 瓦斯汀（对照），各自W1X或10X)和稀释到30ng/mL至90ng/mL的人VEGF的混合溶液分 别W100μL和600μL的体积添加至Transwell和底室，并允许在培养箱中反应过夜。在反 应完成后，移除化answell中的溶液，并且用100μL的葡聚糖-FITC溶液处理化answell。 1小时后，在490nm/520皿测量巧光w检测通过Transwell的葡聚糖。使用不合有VEGF的EBM培养基作为对照。
[0211] 如图10中所示，本发明的抗体W浓度依赖性的模式阻抑由VEGF导致的内皮细胞 渗透性增强（a),运与阳性对照阿瓦斯汀类似化）。
[0212] 实施例13.确认本发明抗体对VEGF诱导的HUVEC迁移的阻抑活性
[0213] 评估本发明抗体HF2-4和HF2-8对VEGF诱导的HUVEC(Clonetics，美国）迁移特 性的阻抑活性。
[0214] 为了定量评估内皮细胞的迁移特性，使用具有3μηι微多孔膜的化answell进行 Boyden室测试。为提高VEGF的反应性，测试前，将在烧瓶中培养的细胞于含有0. 1 %BSA 的EBM-2基础培养基中饥饿4小时W上。将细胞悬浮液W100μL体积中每孔50, 000个细 胞置于上室中，而含有稀释在基础培养基中化g/mL的VEGFW及化g/mL或90ng/mL抗体 (HF2-4或HF2-8)的混合溶液W600μL体积置于下室。
[021引解育24小时后，使用膜蛋白酶分开已经随VEGF的浓度梯度迁移到Transwell的 相对侧的细胞。通过离屯、收集分开的细胞，然后用裂解缓冲液（Invitrogen，美国）裂解。 用DNA染料（Invitrogen，美国）染色经裂解细胞中的DNA，并且在480nm/520皿测量巧光。 在图11中示出结果。
[0216] 图11中的结果表明内皮细胞的迁移特性被人VEGF增强，并且增强的迁移特性可 被抗体HF2-4和HF2-8W浓度依赖性方式阻抑。
[0217] 实施例14 :确认本发明抗体对肿瘤生长的阻抑活性
[021引为评估抗体对肿瘤生长的阻抑活性，将本发明的抗体注射到裸鼠中，在裸鼠中已 经通过植入人癌细胞来形成肿瘤。
[0219] 具体地，将在含有10%FBS和1%青霉素链霉素的McCoy的5A培养基中培养的 2~5X106个HT-29细胞（人结肠癌细胞系HTB-38，ATCC)皮下注射到BALB/c裸鼠（Orient Bio)中。当小鼠中的肿瘤充分生长至约200~300mm3的平均体积时，分别将抗体HF2-1、 HF2-5、HF2-9和HF2-11注射到划分的组中。W3mg/kg或lOmg/kg的剂量一周两次腹膜内 注射抗体。在不同的时间点（第7天、第14天、第21天、第28天和第35天）测量肿瘤的 体积（mm3)。使用缓冲液（PB巧作为阴性对照组，并且在阳性对照组中施用阿瓦斯汀。结果 在图12中示出。
[0220] 如图12中所示，与对照组相比，注射抗体的小鼠中，肿瘤生长被显著阻抑。特别 地，与注射阿瓦斯汀的组相比，注射抗体的组显示出优越得多的肿瘤生长阻抑作用。
[0221] 实施例15 :确认本发明抗体对视网膜新血管形成的阻抑活性
[0222] 为了确认本发明抗体对视网膜新血管形成的阻抑活性，如下进行实验。
[0223] 首先，为了诱导视网膜中的新血管形成，在实验的第0天使用光凝结器（viridis laser,如antel，法国）向小鼠的右眼施加150mW且530皿的激光，持续0. 1秒。损伤后将 投影调整至0.luM。在第0天和第7天，将抗体HF2-4和HF2-11分别Wlug和加g的剂量 注射到右眼球中。在第7天和第14天进行眼底巧光素血管造影术W评估眼底血管发生的 程度。使用PBS作为阴性对照组（载剂），并且使用阿柏西普度ayerhealthcare)作为阳 性对照组（参照药物）。通过化nnett的多重比较检验分析眼底血管造影评分，结果在图 13中示出。
[0224] 如图13中所示，与阴性对照组相比，注射本发明抗体的组显示出对脉络膜血管发 生的优越阻抑作用，并且至少等于市售的比较药物。
[0225] 虽然已经参照W上具体实施方案描述了本发明，然而应当认识到本领域技术人员 可W对本发明进行多种修饰和改变，其也落入由所述权利要求所限定之本发明的范围内。
【主权项】
1. 与血管内皮生长因子（VEGF)结合的抗体，所述抗体包含： 1) 轻链可变区，其包含互补决定区（⑶R)1XDR2和⑶R3,其中所述⑶R2由SEQIDNO 1的氨基酸序列示出；并且⑶R3由SEQIDNO2的氨基酸序列示出；以及 2) 重链可变区，其包含CDRUCDR2和CDR3,其中所述CDR3由SEQIDNO3的氨基酸序 列示出。2. 权利要求1所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含： 1) 轻链可变区，其包含： 由选自SEQIDNO4至14的氨基酸序列示出的⑶R1 ;由SEQIDNO1的氨基酸序列 示出的⑶R2 ;和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的⑶R3 ;以及 2) 重链可变区，其包含： 由选自SEQIDNO15至34的氨基酸序列示出的CDR1 ;由选自SEQIDNO35至50的 氨基酸序列示出的⑶R2 ;和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的⑶R3。3. 权利要求1所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含： 1) 轻链可变区，其由选自SEQIDNO54至65的氨基酸序列示出；以及 2) 重链可变区，其由选自SEQIDNO78至104的氨基酸序列示出。4. 权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含： 1) 轻链可变区，其包含： 由SEQIDNO4的氨基酸序列示出的⑶R1 ;由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的⑶R2 ;和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的⑶R3 ;以及 2) 重链可变区，其包含： 由SEQIDNO15的氨基酸序列示出的CDR1 ;由SEQIDNO35的氨基酸序列示出的 ⑶R2 ;和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的⑶R3。5. 权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含： 1) 轻链可变区，其包含： 由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的⑶R1 ;由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的⑶R2 ;和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的⑶R3 ;以及 2) 重链可变区，其包含： 由SEQIDNO16的氨基酸序列示出的CDR1 ;由SEQIDNO36的氨基酸序列示出的 ⑶R2 ;和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的⑶R3。6. 权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含： 1) 轻链可变区，其包含： 由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的⑶R1 ;由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的⑶R2 ;和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的⑶R3 ;以及 2) 重链可变区，其包含： 由SEQIDNO17的氨基酸序列示出的CDR1 ;由SEQIDNO37的氨基酸序列示出的 ⑶R2 ;和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的⑶R3。7. 权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含： 1)轻链可变区，其包含： 由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的⑶R1 ;由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的⑶R 2 ;和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的⑶R3 ;以及 2)重链可变区，其包含： 由SEQIDNO18的氨基酸序列示出的CDR1 ;由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的 ⑶R2 ;和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的⑶R3。8. 权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含： 1) 轻链可变区，其包含： 由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的⑶R1 ;由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的⑶R2 ;和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的⑶R3 ;以及 2) 重链可变区，其包含： 由SEQIDNO19的氨基酸序列示出的CDR1 ;由SEQIDNO39的氨基酸序列示出的 ⑶R2 ;和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的⑶R3。9. 权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含： 1) 轻链可变区，其包含： 由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的⑶R1 ;由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的⑶R2 ;和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的⑶R3 ;以及 2) 重链可变区，其包含： 由SEQIDNO20的氨基酸序列示出的CDR1 ;由SEQIDNO40的氨基酸序列示出的 ⑶R2 ;和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的⑶R3。10. 权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含： 1) 轻链可变区，其包含： 由SEQIDNO6的氨基酸序列示出的⑶R1 ;由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的⑶R2 ;和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的⑶R3 ;以及 2) 重链可变区，其包含： 由SEQIDNO21的氨基酸序列示出的CDR1;由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的 ⑶R2 ;和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的⑶R3。11. 权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含： 1) 轻链可变区，其包含： 由SEQIDNO6的氨基酸序列示出的⑶R1 ;由SEQID