鉴定阳性克隆，PCR扩增 得到850bp左右的片段即为阳性克隆，35S F:5' -ATGACGCACAATCCCACTATCCTTC-3'。PCR 扩增的反应体系为50yL体系，包括5yL 10X 7hms\Stort?Taq Buffer、4yL 2.5mM dNTPs、lyL 7>WwSto/Y? Taq DNAPolymerase、lyLΙΟμΜ35S F引物、lyLΙΟμΜ Intron4R引物、1μL的菌液作为模板，用ddH20补足至50μL。PCR扩增反应程序为：94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸50s，40个循环，最后72°C延伸lOmin。 将阳性克隆的菌液接种到新鲜无菌的LB液体培养基（含利福平和卡那霉素各50mg/L) 中，28°C200rpm震荡培养至0D600大约为0. 8时，5000rpm离心lOmin,将菌体用MS浸染 液（MS液体培养基+5%蔗糖）重悬，制得用于转化拟南芥的菌液。
[0059] (2)将步骤（1)制备得到的转化拟南芥的菌液通过花序浸染法浸染拟南芥Col-0 野生型植株。在用花序浸染法转拟南芥之前，先用剪刀剪去已经长成的角果，把200mL的MS 浸染液悬浮的菌液倒入大平皿内，然后把拟南芥的花序浸入进去浸染lmin，浸染的过程要 转动平皿，浸染后用滤纸擦干，浸染后的拟南芥植株用保湿袋保湿，暗光处放置16h。然后 取出按照正常的生长条件培养，待种子成熟后收获种子。
[0060] (3)用卡那霉素抗性的平皿筛选转基因种子，用DNA提取试剂盒提取抗性植株叶 片的DNA做PCR检测（用35SF和Intron4R引物检测），PCR扩增的反应体系为50μL体 系，包括 5yLlOXTra似⑧TaqBufTer、4yL2.5mMdNTPs、lyLl?a?1SllSV<2ri?Taq DNAPolymerase、lyLΙΟμΜ35SF引物、lyLΙΟμΜIntron4R引物、lyL的DNA作为模 板，用ddH20补足至50μL。PCR扩增反应程序为：94°C预变性5min;94°C变性30s，55°C退 火30s，72°C延伸50s，40个循环；最后72°C延伸lOmin。图5为转基因拟南芥基因组DNA的 PCR检测结果，扩增出850bp条带的植株即为转基因成功的植株。将转入小菜蛾TOR-RNAi 片段的拟南芥命名为DBM-TORRI/WT。
[0061] 实施例3转基因拟南芥的抗虫能力研究
[0062] 1、小菜蛾的群体饲养
[0063] 用于做抗虫实验的害虫为小菜蛾，在实验室进行繁殖培养，其培养条件为 24°C，16h光照/8h黑暗。用胡萝卜苗的子叶或幼嫩的叶子饲养小菜蛾幼虫，7-8天后结 茧，用毛笔将蛹轻轻地刷下来，移到玻璃缸中，用纱布将口封上，待蛹羽化（约2-3天） 后，放入用10%的蔗糖溶液浸泡过的医用脱脂棉（供小菜蛾成虫食用蔗糖水）和胡萝卜苗 叶子（用于收集虫卵），食用蔗糖水的小菜蛾将在2-3天内产卵，将带有虫卵的胡萝卜苗 叶子收集起来，放到带有滤纸的干净的塑料培养皿中，待虫卵孵化后，用孵化的幼虫做拟 南芥的抗虫性检测实验。
[0064] 2、转TOR-RNAi片段拟南芥对小菜蛾抗性的分析
[0065] 分别用转基因拟南芥DBM-T0RRI/WT三个不同株系T3-2、T3-8、T3-18和野生型拟 南芥WT(作为阴性对照）叶片饲养小菜蛾初孵幼虫，平均每个株系饲喂50头小菜蛾初孵 幼虫，每天早晚各饲喂一次。统计小菜蛾的食叶量、结茧前小菜蛾幼虫的平均质量、结茧前 小菜蛾幼虫的存活率，分别统计了饲喂叶片后第2天、第4天、第6天和第8天的数据。如 图6、7所示，饲喂转基因植株T3-2、T3-18叶片的小菜蛾食叶量和平均重量显著低于对照组 WT，饲喂转基因植株Τ3-8叶片的小菜蛾RNAi效果弱于转基因植株Τ3-2、Τ3-18。从小菜蛾 的存活率来看，如图8所示，随着饲喂转基因叶片时间的增加，小菜蛾的存活率逐渐降低， 到第8天时，饲喂转基因植株Τ3-2、Τ3-18叶片的小菜蛾存活率只有10%左右；而饲喂转基 因植株13-8叶片的小菜蛾存活率在40%左右。从图6、7、8可以看出，转基因植株13-2、 Τ3-18对小菜蛾具有显著的抗虫性。而转基因植株Τ3-8对小菜蛾的抗虫性要弱于转基因植 株Τ3-2、Τ3-18。通过以上实验，说明我们构建的小菜蛾T0R基因RNAi载体在对小菜蛾的 防治上有显著效果，在小菜蛾的基因干涉防治上应用前景广阔。
[0066] 在后续研究中，将对具有显著抗虫效果的转基因拟南芥进行smallRNA测序，找到 对小菜蛾T0R基因干扰最显著的smallRNA，将该smallRNA合成对应的dsRNA，应用在小 菜蛾防治中。
【主权项】
1. 一种分离的多核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示。2. -种分离的多核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。3. -种载体，其特征在于，它含有权利要求1或2所述的多核苷酸。4. 一种重组载体，其特征在于，含有如SEQIDN0:7所示的核苷酸序列，所述重组载体 是以PCR8/GW/T0P0载体为骨架载体，在多克隆酶切位点处插入顺序连接的EcoRI酶切位 点、AsiSI酶切位点、P35S启动子、NotI酶切位点、SEQIDN0:1所示的序列、SbfI酶切 位点、ACTIN的第四个内含子、BbvCI酶切位点、SEQIDN0:1所示序列的反向互补序列、 AscI酶切位点、T35S终止子、EcoRI酶切位点。5. -种小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体，其特征在于：所述RNAi表达载体是以植物 表达载体pEarleyGate303为骨架载体，在重组位点处置换插入顺序连接的EcoRI酶切位 点、AsiSI酶切位点、P35S启动子、NotI酶切位点、SEQIDNO: 1所示的序列、SbfI酶切 位点、ACTIN的第四个内含子、BbvCI酶切位点、SEQIDNO: 1所示序列的反向互补序列、 AscI酶切位点、T35S终止子、EcoRI酶切位点。6. -种含有权利要求5所述RNAi表达载体的微生物转化体。7. -种权利要求5所述的小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体的制备方法，其特征在于， 包括如下步骤： (1) 合成如SEQIDN0:1和2所示的序列，SEQIDN0:1所示的序列命名为TOR-RNAi， SEQIDNO: 2所示的序列命名为35S-IN4,对pCR8/GW/T0P0载体和35S-IN4序列进行酶切 连接，获得含有35S-IN4的载体，命名为p35S-IN4 ; (2) 将步骤⑴合成的TOR-RNAi序列和载体p35S-IN4进行酶切连接得到载体 P35S-T0RIN4； ⑶将载体P35S-T0RIN4和TOR-RNAi序列进行酶切连接得到载体p35S-T0RRI，P35S-T0RRI中含有如Seq ID No :7序列所示的序列； (4)将p35S-T0RRI中插入的SeqIDNo:7序列重组到植物表达载体pEarleyGate303 上，得到小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体。8. -种权利要求1所述的多核苷酸的用途，用于作为制备特异性干扰小菜蛾基因表达 或抑制亚小菜蛾生长的干扰分子的抑制或沉默靶标。9. 一种权利要求1所述的多核苷酸或权利要求2所述的多核苷酸或权利要求3所述的 载体或权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体 在培育抗小菜蛾的转基因植物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用，提供了：分离的多核苷酸，其序列如SEQ？ID？NO:1、2所示；一种载体，它含有SEQ？ID？NO:1或2所示的多核苷酸；一种重组载体，含有如SEQ？ID？NO:7所示的序列；一种小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体及制备方法，是以pEarleyGate？303为骨架载体，在重组位点处置换插入顺序连接的EcoR？I、AsiS？I、P35S启动子、Not？I、SEQ？ID？NO:1的序列、Sbf？I、ACTIN的第四个内含子、BbvC？I、SEQ？ID？NO:1的反向互补序列、Asc？I、T35S终止子、EcoR？I。
【IPC分类】C12N15/54, A01H5/00, C12N15/66, C12N15/82, C12N15/63
【公开号】CN105274122
【申请号】CN201510742083
【发明人】任茂智, 李林宣, 冯丽
【申请人】重庆大学
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月4日