785bp片段。将2片段连接狂bal与SpeI为同尾酶且连接之后 酶切位点消失），转化大肠杆菌D册a，复苏液体培养后获得祀ASY-h地；构建过程如图2所 /J、-O
[0239] 连接体系 10yI:T4连接酶IyI; 10XT4bufferIyI 酶切质粒pAN-Gla3a后 片段5yI;双酶切质粒祀ASY-GlaS后片段3yI;16°C连接过夜。
[0240] 实施例5
[0241] pEASY-TreY-TreZ质粒载体构建：
[0242] 用甜曰1、化〇1双酶切载体祀ASY-h地和载体pSimple-TreY-TreZ，回收7392bp与 6367bp的基因片段，T4连接酶连接两个片段，转化大肠杆菌D册a，复苏液体培养后获得 pEASY-TreY-TreZ;构建过程如图3所示。
[0243] 连接体系10y1 :T4连接酶1y1 ; 10XT4buffer1y1 ;双酶切质粒祀ASY-h地后 片段3y1 ;双酶切质粒pSimple-TreY-heZ后片段5y1 ;16°C连接过夜。
[0244] 实施例6
[0245] pFGL59-TreY-TreZ置换载体的构建：
[0246] 用甜曰1、HindIII双酶切载体祀ASY-TreY-TreZ和载体PFGL59,回收983化P和 7339bp的片段，用T4连接酶连接两个片段过夜，转化到D册a感受态细胞中，复苏后，液体 培养，提取质粒制得PFGL59-化eY-TreZ载体，构建过程如图4所示。
[0247] 连接体系10y1 :T4连接酶1y1 ;10XT4buffer1y1 ;双酶切质粒 pEASY-TreY-TreZ后片段3y1 ;双酶切质粒PFGL59后片段5y1 ;16°C连接过夜。
[024引 实施例7
[0249] 农杆菌介导的黑曲霉的遗传转化：
[0250]将载体PFGL59-化eY-TreZ通过根癌农杆菌AGLl介导的黑曲霉转化法转化到黑曲 霉F0410,筛选得到纯转化子。
[0巧1] (i)农杆菌感受态的制备：
[0巧2] 挑取农杆菌AGLl单菌落接种至含有利福平巧if) 50mg/L的20化液体Y邸培养基 中，28°C，200rpm振荡培养过夜；取初次活化的菌液按1:10的比例接种于20mL含抗生素的 液体Y邸培养基中，相同条件下继续培养5~化至ODe。。在0. 4~0. 6之间；将菌液分装到 1. 5血离屯、管中，冰浴30min。4°C，8000巧m离屯、5min，弃上清；用100JiL预冷的20mmol/L 化CI2将菌体重悬。
[0巧3] (ii)冻融法转化农杆菌：
[0巧4] 取1yL重组质粒DNA，加入到农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀；冰浴5min，液氮冷 冻Smin，迅速转移至37 °C水浴锅中溫欲融化；加入800yL新鲜Y邸液体培养基，28 °C，慢摇 4~化；12000;rpm离屯、Imin,弃上清，用100JiL新鲜液体YEB重悬菌体，涂布在KanlOOmg/ 血、Ri巧Omg/L的YEB固体平板上，28°C培养48~96h，直至长出单菌落；
[0巧引 （iii)农杆菌转化子PCR鉴定：
[0256] W冻融法转化平板上长出的单菌落作为模板，利用基因特异性引物进行PCR验 证，W质粒pFGL59-TreY-TreZ为阳性对照，水为阴性对照，检测是否将麦芽寡糖基海藻糖 合成酶基因TreY与麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因TreZ融合基因TreY-TreZ转化到了农杆 菌中，对鉴定正确的农杆菌转化子保存备用；
[0巧7] (iv)农杆菌的培养及处理：
[0巧8] 挑取农杆菌AGLl转化子单菌落于5血液体YEB中（含化f50mg/mL，KanlOOmg/ mL)，200巧m，28°C培养过夜；取初次活化菌液转入Y邸液体培养基中（含200umol/L乙酷下 香酬，Rif50mg/血，KanIOOmg/血)，菌液浓度调整到660皿处吸收值为0. 25左右；继续培 养5~化，使得660皿处吸收值为0. 6~0. 9备用。
[0259] (V)农杆菌与黑曲霉的共培养：
[0260] 分别取液体马铃馨培养基静置培养4天的黑曲霉菌丝体200yL和农杆菌液体 100JiL于5000巧m离屯、5min后去上清；将菌丝体和农杆菌分别用100JiL新鲜液体马铃馨 培养重悬后混合；将混合菌体涂布到铺有玻璃纸的PDA(含200ymol/L乙酷下香酬）平板 上，28°C共培养48~72h。
[0261] (Vi)黑曲霉转化子的筛选：
[0262] 将共培养平板上的玻璃纸转到PDA(含200mmol/L潮霉素B，500mg/L)筛选平板 上；将筛选平板于32°C培养一周W上，直至观察到抗性菌落有明显生长；挑取抗性菌落于 20mL的液体马铃馨培养基（含200mmol/L潮霉素B)中，进行二次筛选；对二次筛选时正常 生长的黑曲霉菌丝体提取基因组，并通过同源臂引物（Gla5-F，Gla3-R)进行PCR验证，筛选 阳性转化子；
[0263] (Vii)同源重组转化子的鉴定及纯合同源重组转化子的筛选：
[0264] 提取二次筛选仍然正常生长的黑曲霉基因组，分别用糖化酶同源臂引物（Gla5-F， Gla3-R)和同源重组引物化地-F，hph-R)对转化子进行PCR检测，筛选同源重组转化子。 由于转化受体黑曲霉为多核菌丝，为分离出纯合的同源重组转化子，需将同源重组菌株在 200mmol/L潮霉素B的PDA液体和固体培养基上连续传代、筛选，提取基因组DNA，用糖化酶 同源臂引物（Gla5-F，Gla3-R)做PCR鉴定，检测的菌落只扩增出6367bp的目的条带，没有 4500bp的糖化酶基因条带，表明该菌落为纯合的同源重组菌株。
[0265] (Viii)同源重组菌株中潮霉素抗性基因的消除：
[0266] 将同源重组菌株在不含潮霉素B的PDA液体培养基中多次连续传代，然后将同源 重组转化子菌丝体均匀地涂布在PDA平板上，32°C培养3~4d后将平板上长出的单菌落 一一对应地挑取一部分转移至含200mmol/L潮霉素B的PDA平板上，W出发菌株为阴性对 照，32°C培养3~4山观察生长情况，如图6所示。对在含200mmol/L潮霉素B的PDA平板 上不能生长的菌落，提取基因组DNA，分别用糖化酶同源臂引物（Gla5-F，Gla3-R)和同源重 组引物化地-F，hph-R)进行PCR鉴定，潮霉素抗性基因删除过程如图5所示。最后得到纯 合的同源重组菌株黑曲霉（Aspergillusnige;r)F0410-MM，如图7所示。
[0267] 同源重组引物序列如下：
[0268] h地-F:5, -GACAATGGCCGCATAACAG-3，
[0269] hph-R:5, -GAAGCCTTGAGCGACGAAT-3，
[0270] 上述LB培养基每升组分如下：10g化Cl,IOg蛋白腺，5g酵母提取物，pH7. 0。固 体培养基需加入20g的琼脂；
[0271] 上述YEB培养基每升组分如下：5g牛肉膏，5g蛋白腺，5g薦糖，Ig酵母提取物， 0. 493gM拆〇4 ? 7&0,抑7. 0。固体培养基需加入20g的琼脂；
[027引上述PDA培养基每升组分如下：200g马铃馨，20g葡萄糖，3gKH2PO4,1. 5g M拆O4? 7&0。固体培养基需加入20g的琼脂；
[0273] 注：取去皮马铃馨200g，切成片状小块，加水1000血煮沸30min，滤去马铃馨块。
[0274] 实施例8
[0275] 麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶的融合酶在重组菌中表 达：
[0276] 在纯合同源重组菌株中，糖化酶基因已经被麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因TreY 与麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因TreZ的融合酶基因TreY-TreZ所替换，失去出发菌株 AspergillusnigerCICIMF0410对液化淀粉的利用能力，因此，重新改良糖化酶发酵 培养基条件下（每升培养基含40g液化淀粉、100g葡萄糖、20mL玉米浆、20g豆饼粉，PH 5. 5~6. 0)，首先将培养好的已经删除h地基因的纯合同源重组菌株黑曲霉（Aspergillus niger)F0410-MM和出发菌株黑曲霉（Aspergillusniger)F0410的斜面抱子接入PDA培养 基，于28°C，200r/min摇床上摇瓶培养2地，抽滤菌丝体，转接到改良的诱导产酶的培养基 中，培养过程中检测发酵液上清进行酶活，W及发酵液上清的液化淀粉被分泌到胞外的麦 芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶的融合酶酶解转化成的海藻糖含量。
[0277] 结果显示，在发酵过程中，出发菌株黑曲霉（Aspergillusniger)F0410发酵 液上清没有检测到麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶的两种酶的活 性，通过液相色谱仪分析法检测不到发酵液上清含有海藻糖。然而当培养同源重组菌株 AspergillusnigerF0410-MM时，培养到6d时酶活达到最高，发酵液上清中融合酶能够同 时展示出麦芽寡糖基海藻糖合成酶（比酶活：260.lU/mg)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（比 酶活：270. 9U/mg)两种酶的活性，且融合酶的酶学性质与融合之前的两种酶相似（最适抑 值均在5. 5左右，最适溫度均为50°C)，W500U/L的添加量在50°C下转化20%的淀粉乳液 20小时所得的海藻糖转化率可达92 %，到达相同转化率时间较双酶法相比节约了近5. 6小 时。同时通过液相色谱仪分析法测定其发酵液上清的液化淀粉被分泌到胞外的麦芽寡糖基 海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶的融合酶酶解转化成的海藻糖含量为4. 8mg/mL。
【主权项】
1. 一种制备食品级海藻糖的黑曲霉工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 分别PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因TreY与麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因 TreZ，同时PCR扩增黑曲霉糖化酶基因的上游基因片段Gla5和下游基因片段Gla3、Gla3a; 所述的黑曲霉糖化酶基因的上游基因片段Gla5的核苷酸序列如SEQIDNO. 1 ;所述的黑曲 霉糖化酶基因的下游基因片段Gla3的核苷酸序列如SEQIDNO. 2 ;所述的黑曲霉糖化酶基 因的下游基因片段Gla3a的核苷酸序列如SEQIDNO. 3 ; (2) 采用重叠PCR技术，将步骤（1)制得的麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因TreY与麦 芽寡糖基海藻糖水解酶基因TreZ拼接，制得TreY-TreZ融合基因片段，TreY-TreZ融合基 因片段的核苷酸序列如SEQIDNO. 4所示以及氨基酸序列如SEQIDNO. 5所示，然后将步 骤（1)制得的黑曲霉糖化酶基因的上游基因片段Gla5与TreY-TreZ融合基因拼接，制得 Gla5-TreY-TreZ片段，然后将黑曲霉糖化酶基因的下游基因片段Gla3与Gla5-TreY-TreZ 片段拼接，制得Gla5-TreY-TreZ-Gla3片段； (3) 将步骤（2)制得的Gla5-TreY-TreZ-Gla3片段与pMD18-TSimple连接，获得重组 质粒pSimple-TreY-TreZ;将步骤（1)制得的黑曲霉糖化酶基因的下游基因片段Gla3a与 PMD18-T载体连接，制得pMD-Gla3a质粒； (4) 用Xbal、BamHI双酶切载体pAN7-l，回收6031bp的基因片段，Xbal、Bglll双酶切 步骤（3)制得的pMD-Gla3a质粒，回收1213bp的基因片段，连接上述回收的基因片段，构建 载体pAN_Gla3a; (5) 在Gla5基因上游引物5'端引入一个Xbal位点，然后与pEASY-Blunt载体连接，构 建质粒载体pEASY-Gla5 ; (6) 用限制性内切酶Xbal、Xhol、Dral三酶切步骤（4)制得的载体pAN-Gla3a，回收 3470bp的基因片段，XhoI、SpeI双酶切步骤（5)制得的质粒pEASY-Gla5,回收3785bp的基 因片段，连接上述回收的基因片段，构建载体pEASY-hph; (7) 用限制性内切酶XbaI、Xh〇I双酶切步骤（6)制得的载体pEASY-hph和步骤⑶制 得的重组质粒pSimple-TreY-TreZ，回收7392bp与6367bp的基因片段，连接上述回收的基 因片段，构建载体pEASY-TreY-TreZ; (8) 用限制性内切酶XbaI、HindIII双酶切步骤（7)制得的载体pEASY-TreY-TreZ 和载体PFGL59,回收9831bp和7339bp的基因片段，连接上述回收的基因片段，制得 pFGL59-TreY-TreZ载体； (9) 将pFGL59-TreY-TreZ载体通过根癌农杆菌AGL1介导的黑曲霉转化法转化到黑曲 霉F0410中，经筛选，获得制备食品级海藻糖的黑曲霉工程菌。2. 如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1)中，麦芽寡糖基海藻糖合 成酶基因TreY是以·尼古丁节杆菌（Arthrobacternic