一种发酵生产青蒿酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及工业微生物技术领域，具体涉及一种发酵生产青蒿酸的方法。
【背景技术】
[0002]疟疾这种疾病威胁着全球三至五亿人的健康，2010年，全世界总共有2亿人次感染疟疾，并至少夺去了 65.5万人的生命。
[0003]青蒿素(artemisine)是从中药黄花蒿中提取的含过氧基团的倍半猫内酯抗痕新药，是中国发现的第一个被国际公认的天然药物，在其基础上合成了多种衍生物，如双氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯等。青蒿素类药物毒性低、抗疟性强，被WT0批准为世界范围内治疗脑型疟疾和恶性疟疾的首选药物。青蒿素等抗疟药在非洲等地广泛使用，在与疟疾的抗击中，中国药物获得非洲国家的广泛赞誉，非洲的抗疟药主要来自中国。
[0004]目前，青蒿素主要有三种生产方法，一是传统的从青蒿中提取，该方法受气候、地域的影响大，产量不稳定；二是通过化学全合成获得，此方法难度极大，成本高昂；第三种方法是采用基因工程技术通过微生物发酵获得青蒿酸，再半合成青蒿素，该方法产量高，稳定，生产成本低，是一个相对来说比较廉价、环保和高效的办法。
[0005]使用第三种方法生产青蒿素时，关键中间体青蒿酸对最终产品的收率和生产成本有很大影响。专利CN200710187922.8公开了一种通过将GYP71AV1 P450基因和P450还原酶CPR基因导入酿酒酵母细胞来获得青蒿酸基因工程菌从而生产青蒿酸的方法；US7192751B2公开了一种在宿主细胞中导入不同的核苷酸序列编码不同的酶生产萜类化合物的方法；US7541172B2公开了一个编码多肽的独立DNA序列，其具有合成萜类化合物的活性，并通过将该序列导入细菌、酵母、植物细胞来生产萜类化合物；文献Engineering amevalonate pathway in Escherichia coli for product1n of terpenoudes (VincetJJ Martin 等，Nat B1technol.2003 Jul; 21(7): 796-802.)构建了一种合成紫穗槐-4，11-二烯合成酶基因和来自酿酒酵母中大肠杆菌中的甲羟戊酸类异戊二烯途径的表达° 文献 Product1n of the artemisinin precursor amorpha-4，11-diene byengineered saccharomyces cervisiaeikrm-Louise Lindahl 等，B1technol Lett.2006Apr ;28(8):571-80.)介绍了两种不同的从青蒿紫穗槐_4，11- 二烯合成酶编码基因转化到酿酒酵母中的方法。
[0006]上述文献主要关注生产青蒿酸前体的基因工程菌的构建，对发酵过程中产物的产量的提高关注较少。青蒿酸发酵过程中随着产物量的不断积累，将会对生产菌株本身造成毒性，从而抑制产物的继续合成。普遍的，由于有机溶剂会杀死菌丝体，因此在发酵中很少会使用有机溶剂，即使有些发酵过程用到的消泡剂和分散剂是有机溶剂，但其用量也是非常少的。发明人意外的发现通过在发酵过程中向发酵液中加入水不溶性有机溶剂，所使用的水不溶性有机溶剂不仅不会杀死菌体，而且还可以在发酵的同时，将产物从发酵液中萃取到溶剂中，减轻产物对菌体的毒害作用，使生物合成可以继续下去，从而显著提高发酵单位。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种可以有效提高青蒿酸发酵单位的方法，从而降低生产成本。
[0008]为实现上述目的，本发明采用了下述的技术方案:
一种发酵生产青蒿酸的方法，包括以下步骤:
1)将种子液接入到含发酵培养基的发酵罐中培养，培养14~18小时后，向发酵罐中连续补加葡萄糖和乙醇至发酵结束；
2)培养24h~48h后，向发酵罐中补加水不溶性有机溶剂，连续补加至发酵结束；
3)发酵结束后，放罐，分离，得到含青蒿酸的有机相。
[0009]其中，步骤1)将种子液接入到发酵罐中培养之前，优选先接入到摇瓶中放大。
[0010]进一步的，步骤1)中所补加的葡萄糖浓度为30%~60% ;所述葡萄糖以流加方式加入到发酵罐中，每小时加入量为发酵液体积的0.1%~1%。
[0011]步骤1)所补加的乙醇浓度为70%~99.7% ;以流加方式加入到发酵罐中，每小时加入发酵液体积的0.2%~0.8%。
[0012]进一步的，优选步骤1)中所补加的葡萄糖浓度为50%，以流加方式加入到发酵罐中，优选每小时加入发酵液体积的0.4% ;优选所补加的乙醇浓度为95%，以流加方式加入到发酵罐中，优选每小时加入发酵罐液体积的0.5%。
[0013]进一步的，步骤2)中所述水不溶性有机溶剂为烷烃类溶剂或芳香烃类溶剂；优选所述的烷烃类溶剂为(V12。所述Qn2的烷烃类溶剂包括含6~12个碳原子的环烷烃如环己烷，环庚烷，环辛烷等，或含6~12个碳原子的链烷烃如正己烷，正庚烷，正辛烷，正i^一烷，正十二烷等；所述的C6?12的烷烃类溶剂优选为正己烷；所述的芳香烃类溶剂优选为甲苯，邻二甲苯，间二甲苯或对二甲苯。
[0014]进一步的，步骤2)中所述水不溶性有机溶剂还可以选自甲基异丁酮。
[0015]进一步的，步骤2)中所述水不溶性有机溶剂加入到发酵液中的总体积为发酵液体积的4%~20%，加入速度为每天加入1%~5%的发酵液体积。
[0016]更具体的，本发明所述发酵生产青蒿酸的方法，包括以下步骤:
1)、将冷冻保存的种子液(生产青蒿酸的酿酒酵母)约lrnl接入含有约100ml培养基的750ml摇瓶中，25°C ~35°C培养24h，接入含有7L发酵培养基的发酵罐中培养；
2)、发酵培养14~18h，优选16h以后，通过流加补入葡萄糖和乙醇，葡萄糖的浓度为30%~60%，补加速度为每小时补入发酵液体积的0.1%~1% ;乙醇的浓度为709Γ99.7%，补加速度为每小时补入发酵液体积的0.2%~0.8% ;发酵过程中将溶氧控制在20%以上，根据溶氧变化调整葡萄糖和乙醇的补加速度；
3)、发酵培养24h~48h后，流加补入水不溶性有机溶剂，例如烷烃类溶剂(如Qn2的烷烃类溶剂)、芳香烃类溶剂(如甲苯，邻二甲苯，间二甲苯或对二甲苯等)、或甲基异丁基酮等水不溶性溶剂，直至发酵结束；所述水不溶性有机溶剂补加速度为每天加入1%~5%体积的发酵液，合计补加体积为发酵液体积的4%~20%。
[0017]4)、发酵培养120h~140h后放罐，离心，收集有机相，通过浓缩、结晶获得产品。本发明所述的“种子”是指能生产青蒿酸的酿酒酵母。
[0018]本发明所用的培养基是含碳源，氮源，以及维生素和微量元素的溶液，其中以糖类，优选葡萄糖作为碳源；氨基酸作为氮源；所述维生素溶液包含生物素，泛酸钙，烟酸，肌醇硫胺素，烟酸吡哆醇及对氨基苯甲酸等；所述微量元素溶液是包含Zn，Mn，Cu，Co，Mo，Ca，Fe等元素的溶液。
[0019]本发明所述的将种子液接入到摇瓶中扩大，是指将种子瓶于30°C下摇床220rpm培养24h ;发酵罐温度25°C ~30°C，搅拌转速20(T800rpm，空气流量420L~840L/h，发酵全过程溶氧控制在20%以上。
[0020]另一方面，本发明还提供了所述方法制备的青蒿酸，其在制备青蒿素中的用途。
[0021]本发明提供的制备青蒿酸的方法与现有技术相比具有显著的技术效果，主要体现以下几个方面:
1、本发明通过在发酵过程中向发酵液中加入水不溶性有机溶剂，不仅所使用的水不溶性有机溶剂不会杀死菌体，而且还可以在发酵的同时，将产物从发酵液中萃取到溶剂中，减少产物对微生物细胞的毒害，延长生物合成的时间和效率，跟现有文献(Product1nof the artemisinin precursor amorpha-4, 11-diene by engineered saccharomycescervisiae (Ann-Louise Lindahl 等，B1technol Lett.2006 Apr; 28 (8): 571-80.)工艺的发酵产量相比，产量提高超过40% ；
2、简化了提取工艺。常规发酵培养在发酵完成后，要进行发酵液的固液分离，然后再用有机溶剂将产物从菌渣中浸提出来。本发明在发酵完成后，产物绝大部分已经溶于有机相中，通过离心或者分液收集有机相即可直接进行后续纯化步骤，减少了生产工序，显著提高生产效率；
3、本发明提供的方法简单易行，重复性好，所用有机溶剂为常规溶剂，生产成本低，适合于工业化生产。
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不意味着对本发明有任何限制。
[0023]本发明所用的菌种为本实验室保存的可以生产青蒿酸的酿酒酵母{Saccharomyces cereKisiae),菌种的获得方法参考“Product1n of the artemisininprecursor amorpha-4, 11-diene by engineered saccharomyces cervisiae (Ann-LouiseLindahl 等，B1technol Lett.2006 Apr