Idh1/2基因突变检测体系及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因突变的检测产品W及该产品所用到的引物、探针、检测体系， 属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 异巧樣酸脱氨酶（isocitratedehy化ogenase，IDH)是一类在Η駿酸循环中起重 要作用的酶家族，不仅在能量代谢、氨基酸和维生素合成中扮演重要角色，而且对该酶的活 性调节将直接影响IDH或IDH底物参与不同的生物途径、发挥不同的生物功能。在哺乳动 物细胞中，IDH同工酶有Η种形式：依赖NAD的线粒体IDH，依赖NADP的线粒体IDH，依赖 NADP的胞质IDH。
[0003] 编码依赖NADP的人异巧樣酸脱氨酶1(isocitratedehy化ogenase1，IDH1)的 基因位于染色体2q33. 3,其转录mRNA长2339bp，含有10个外显子，编码由414个氨基酸残 基组成的异巧樣酸脱氨酶1，主要定位于细胞浆和过氧化物酶体。IDH1作用于一个称为巧 樣酸周期的能量生成途径。细胞溶质的IDH1突变是原发性人体脑瘤主要亚型的共同特点。 研究表明癌症相关的IDH1突变使该酶具有新的作用，当精氨酸132突变为组氨酸时，活性 部位残基所产生的结构变化倾向于减少IDH1对异巧樣酸盐的氧化脱駿作用；催化NADK1依 赖性的还原反应，把α-丽戊二酸还原成2-居基戊二酸（2HG)。2HG作为异巧樣酸脱氨 突变后生成并累及的代谢废物，一般在人体细胞中含量很低，如果大量累积，就会导致正常 细胞向恶性转化。2HG通过对DNA、组蛋白甲基化、缺氧诱导因子Ια化ypoxiain化cible factor-1，HIFlα)和HIF2α的作用改变了基因的转录；2HG过多累积会直接抑制包括人体 内''组蛋白去甲基化酶"与DNA去甲基化酶在内的多个重要双加氧酶的活力，双加氧酶的活 力降低，改变细胞的增殖和生长方式，进而诱发肿瘤。已证实2HG的过度蓄积将导致患有先 天性2HG代谢异常的患者出现恶性脑瘤风险升高。同样，在人体恶性神经胶质瘤部位，研究 发现2HG水平显著升高。
[0004] 另一方面，化an等人发现IDH1突变会释放他们称为的"表观遗传混乱 (巧igeneticchaos)"而干扰一种能调控DNA甲基基团积累的酶的作用。送种"甲基化"能 开启和关闭基因表达。IDH1突变的脑癌具有改变了的DNA甲基化模式；同时他们还发现表 达突变IDH1的星形胶质细胞发育出一个与DNA甲基化相呼应的像干细胞一样的表型，表明 突变IDH1可能防止了分化。复旦大学的研究人员曾发现肿瘤衍生的IDH1突变会破坏酶 的亲和力，导致酶与底物结合能力降低，并且突变的IDH1还能与野生型IDH1竞争底物，突 变的IDH1与底物结合形成二聚体，进一阻断IDH1的活性；据此提出IDH1具有肿瘤抑制子 的作用，一旦ΙΜΠ发生突变失活则导致HIF-1通路发生改变促进肿瘤发生。
[0005] 编码依赖NADP的线粒体ID肥酶的ID肥基因位于染色体15q26. 1。其转录mRNA 长1740bp，编码由452个氨基酸残基组成的异巧樣酸脱氨酶2.其与IDH1基因具有较高的 同源性，其突变同样与脑胶质瘤的发生发展相关。
[0006] 研究表明，在12%的人脑胶质瘤中存在I畑1基因Argl32位点的突变。在 和IV胶质瘤中，送种突变率更是达到了 71. 37 % ,64.31 %和76. 42%。Yan等研究显示， 17. 1%的胶质瘤患者携带有I畑1基因R132突变，1%患者携带ID肥基因R172突变。另据 mycancergenome网站的统计数据表明，神经胶质瘤中I畑1基因突变发生的频率为33. 0%， ID肥基因突变发生的频率为1. 7%，其中ΙΜΠ基因突变中87. 6%为C. 395G〉A(R132H)， 2. 9%为C.394C〉T(R132C);其中ID肥基因突变中 58. 2%为C.515G〉A(R172K)。IDH1/2 的 体细胞突变与神经胶质瘤病理亚型、遗传图谱和临床特征紧密相关，已成为神经胶质瘤最 重要的分子标记之一。
[0007] 另一方面的研究还显示I畑1和ID肥都参与了细胞内氧化损伤的防御机制，但 IDH1在脂质的代谢机制中起了重要作用。通过全基因组测序发现IDH1和IDH2突变存在 于急性髓系白血病（AML)、急性淋己细胞白血病（ALL)及骨髓增殖性疾病（MPD)中，在慢 性粒细胞白血病（CML)中尚未检测到突变。2012年化tel等人的研究显示，带有正常核型 和核磯蛋白（Nueleo地osmin，NPMl)基因突变的病人中，IDH2基因突变与急性髓系白血病 (AML)预后良好相关。文献报道ΙΜΠ和IDH2突变在原发性正常核型急性粒细胞白血病 (CN-AML)患者中的发生率分别为5. 5~9. 6%和3~11%，并认为具有ΙΜΠ和ID肥突变 的AML患者具有较低的CR,较高的RR和较短得0S。另据mycancergenome网站的统计数据 表明，在AML中，I畑2基因突变发生的频率为6. 4%，I畑2基因突变发生的频率为9. 1 %，其 中IDH1 基因突变中 34. 5%为C.3940T巧1320,24. 5%为C.395G〉A(R132H) ;ID肥基因突 变中 74. 8%为C.419G〉A(R140曲，20. 9%为C.515G〉A巧 172K)。
[0008] IDH1/2基因突变检测对于胶质瘤和血液病患者意义重大，可辅助肿瘤病理正确诊 断、分型及分级，判断肿瘤预后，指导临床治疗。同时该检测对肿瘤发病机制的研究具有重 要意义，也有利于针对IDH1/2基因不同突变型的相关治疗药物开发。
[0009] 由于临床上的需求，目前已有针对检测I畑1/2基因突变的商业化应用，如广州好 芝生物科技有限公司开发的"人类IDH1/IDH2基因突变检测试剂盒"，其基于英光PCR-HRM 法，可检测1~5%的基因突变。开发一种检测IDH1/2基因热点突变的产品，W实现更高灵 敏度、更低成本、更方便快捷的IDH1/2基因突变检测是非常有必要的。
【发明内容】
[0010] 本发明要解决的技术问题是提供一种可W覆盖多突变位点检测，模板量低，且快 速、准确、高灵敏度的IDH1/2基因突变检测体系及其试剂盒。
[0011] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是；一种IDH1/2基因突变检测 体系，包括引物、探针和扩增阻断引物；
[0012] 所述引物包括质控正向引物、检测正向引物和通用反向引物；
[0013] 所述质控正向引物包括针对ΙΜΠ基因C394T/G395A位点核巧酸序列如SEQID No. 1所示的质控正向引物和针对ID肥基因G419A/G515A位点核巧酸序列如SEQIDNo. 2 所示的质控正向引物；
[0014] 所述检测正向引物包括针对ΙΜΠ基因C394T突变位点核巧酸序列如SEQIDNo. 3 所示的检测正向引物、针对IDHl基因G395A突变位点核巧酸序列如SEQIDNo. 4所示的检 测正向引物、针对ID肥基因G419A突变位点核巧酸序列如SEQIDNo. 5所示的检测正向引 物、针对ID肥基因G515A突变位点核巧酸序列如SEQIDNo. 6所示的检测正向引物；
[0015] 所述通用反向引物作为检测反向引物和质控反向引物使用，包括针对1畑1基因 C394T/G395A位点核巧酸序列如SEQIDNo. 7所示的通用反向引物和针对ID肥基因G419A/ 65154位点核巧酸序列如569 10齡.8所示的通用反向引物；
[0016] 所述探针包括针对ΙΜΠ基因C394T/G395A位点的核巧酸序列如SEQIDNo. 9所 示的探针、针对ID肥基因G419A位点核巧酸序列如SEQIDNo. 10所示的探针和针对IDH2 基因G515A位点核巧酸序列如SEQIDNo. 11所示的探针，所述探针序列的5'端设有一种 英光标记，所述探针的核巧酸序列的3'端设有另一种英光标记；
[0017] 所述扩增阻断引物是针对ID肥基因G419A位点核巧酸序列如SEQIDNo. 12所示 的扩增阻断引物，所述扩增阻断引物的核巧酸序列的3'端设有磯酸化修饰。
[0018] 本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是；一种IDH1/2基因突变检 测体系，包括引物、探针和扩增阻断引物；
[0019] 所述引物包括质控正向引物、检测正向引物和通用反向引物；
[0020] 所述质控正向引物包括针对ΙΜΠ基因C394T/G395A位点核巧酸序列如SEQID No. 1所示的质控正向引物和针对ID肥基因G419A/G515A位点核巧酸序列如SEQIDNo. 2 所示的质控正向引物；
[0021] 所述检测正向引物包括针对I的Π基因C394T突变位点核巧酸序列如SEQID No. 13所示的检测正向引物、针对ΙΜΠ基因G395A突变位点核巧酸序列如SEQIDNo. 14所 示的检测正向引物、针对ID肥基因G419A突变位点核巧酸序列如SEQIDNo. 15所示的检 测正向引物、针对ID肥基因G515A突变位点核巧酸序列如SEQIDNo. 16所示的检测正向 引物；
[0022] 所述通用反向引物作为检测反向引物和质控反向引物使用，包括针