伪狂犬病病毒双荧光标记5基因缺失株的构建的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株双荧光标记5基因（gE、gl、US9、UL49. 5、TK)缺失伪狂犬病病毒 的构建，属于生物技术和动物病毒学领域。
【背景技术】
[0002] 伪狂犬病（Pseudorabies，PR ;又名 Aujeszky' s disease，AD)是由伪狂犬病病毒 (Pseudorabies virus，PRV)引起的一种急性传染病，可感染多种家畜、伴侣动物及野生动 物。猪是感染后可以存活的唯一物种，也是病毒贮存宿主。感染猪主要表现为神经症状、流 涎、呼吸困难、母猪繁殖障碍、仔猪高死亡率等，给养猪业造成巨大的经济损失。
[0003] PRV是疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科、水痘病毒属的成员。PRV基因组为线性双股 DNA，约145Kb，由长独特区（UL)和短独特区（US)及US两侧的末端倒转重复（TR)与内部 重复（IR)组成，可编码70-100种蛋白质，成熟的病毒粒子约有50种蛋白。在上述基因产 物中，UL区段中的gC、TK及US区段中的PK、gG、gl、gE、llK和28K为病毒增殖的非必需成 份，一般认为，TK、gC、gE、PK和CP (衣壳蛋白）等与PRV毒力相关。另外，疱疹病毒基因组 中，UL49. 5编码的囊膜蛋白gN能抑制TAP介导的多肽转运到内质网，在病毒感染的细胞内 阻断MHC I类复合体的装配，从而下调MHC I类分子在细胞表面的表达，使得病毒有可能逃 避宿主CDS+T细胞的识别，并在宿主鼻腔及上呼吸道上皮细胞中复制，引起化脓性反应或组 织溃烂，进而导致细菌二次感染及严重的肺炎。
[0004] 疫苗免疫接种是防制伪狂犬病的主要策略。伪狂犬疫苗主要分为三种：一是常 规疫苗，即灭活疫苗和弱毒活疫苗，如目前应用较多的Bartha-Kei株活疫苗；二是基因缺 失疫苗，即通过分子生物学方法，人工缺失某些基因，使其毒力减弱的同时又保留其免疫原 性。目前构建的伪狂犬病病毒基因工程疫苗大多为TK、gl、gE、gG基因的单基因缺失或多 基因缺失突变株。
[0005] PRV作为基因工程载体具备相当的优势：（I)PRV不感染人，具有很好的安全性。现 有的活疫苗株Bartha-K61或'783'等在世界上已应用了几十年，未发生重大的安全事故。 (2)基因组容量大：在PRV长达145Kb的基因组中，约一半基因被认为是非必需的，如gl、 gE、gM、TK、PK、gC和dUTPase等，在这些区域可先后或同时插入和表达多种外源基因而不 显著影响其繁殖及免疫原性。（3)生产原材料来源方便，生产成本低：PRV疫苗可以接种SPF 鸡胚成纤维细胞及PK15、ST等传代细胞生产，原材料充足，生产工艺成熟，且PRV病毒滴度 很容易达到免疫要求，大大降低了生产成本。（4)免疫期长：PRV以细胞免疫为主，病毒可以 较长时间感染，外源基因可以在体内持续表达。（5)宿主范围广，多种家畜、经济动物（如狐 和貂）、伴侣动物及野生动物均可感染PRV，可研制针对不同动物的活载体疫苗。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是将自行分离并经鉴定命名为伪狂犬病病毒SX株作为亲本毒，经 基因工程方法构建缺失gE、gl、US9、部分UL49. 5基因和TK基因并插入GFP和RFP标记的 重组病毒；并以该重组病毒作为疫苗候选毒株或伪狂犬活病毒载体系统，用于基因工程疫 苗的开发和应用。
[0007] 本发明的技术方案
[0008] 1. -种伪狂犬病病毒株，其特征在于所述该病毒株为伪狂犬病毒（Pseudorabies virus)rPRV/gE _ /gl _ /US9 _ / Λ UL49. 5/TK _ /GFP+/RFP+株已于 2015 年 11 月 11 日送交 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No. 11493。
[0009] 2. 一种伪狂犬病病毒株，其特征在于该伪狂犬病病毒株同时缺失了 gE基因、gl基 因、US9基因、TK基因和部分UL49. 5基因五种伪狂犬病病毒基因，在基因缺失的部位通过同 源重组分别插入绿色荧光蛋白（GFP)基因和红色荧光蛋白（RFP)基因作为标记物。
[0010] 3.如权利要求1所述伪狂犬病病毒株，其特征在于缺失的UL49. 5部分基因包括其 所表达的gN蛋白的胞外域37~40氨基酸所对应的12个核苷酸序列及胞质尾区（CT)全 部51个核苷酸序列。
[0011] 4.如权利要求1所述的伪狂犬病病毒株的构建方法，其特征在于该毒株构建的步 骤为：
[0012] (1)亲本毒株：用自主分离和鉴定并命名为伪狂犬病病毒（PRV)SX株作为亲本毒 株；
[0013] (2)转移载体的构建：以pMD-18T克隆载体为骨架载体，构建四种转移载体： 第一种转移载体为PMD-US6-GFP-US2,插入伪狂犬病病毒gl、gE和US9两端的US6 和US2部分基因序列作为同源臂，左右同源臂间插入GFP基因；第二种转移载体为 PMD-UL50-UL49. 5- Λ 37~40-CT-RFP-UL49,插入UL49. 5基因 CT序列两端部分基因序列 作为同源臂，左右同源臂间插入RFP基因；第三种转移载体为PMD-UL50-UL49. 5- Λ 37~ 40-CT-UL49,插入UL49. 5基因 CT基因两端部分基因序列作为同源臂，将第二种转移载体 引入的RFP基因敲除；第四种转移载体为pMD-UL24-RFP-UL22,插入伪狂犬病病毒TK基因 两端的UL24和UL22部分基因序列作为同源臂，左右同源臂间插入RFP基因；
[0014] (3)双荧光标记缺失病毒的构建：首先将（2)中的pMD-US6-GFP-US2转移载体 与亲本株PRVSX株共转染ΡΚ15细胞，通过克隆筛选，获得含GFP标记蛋白的缺失病毒株 (rPRV/gE /gl /US9 /GFP+株）；第二步将上一步缺失株与 pMD-UL49. 5- Λ 37-40-CT-RFP 转 移载体共感染ΡΚ15细胞，筛选出缺失株（rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/GFP+/RFP+株）后， 再通过同源重组将RFP标记基因敲除；第三步将筛选的rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5缺失 株再与PMD-UL24-RFP-UL22转移载体共转染ΡΚ15细胞，通过克隆筛选获得双荧光标记缺失 病毒 rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/RFP+株。
[0015] 5.权利要求1所述的伪狂犬病病毒株的应用，其特征在于rPRV/gE/gl / US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/RFP+株作为候选毒株，敲除其中GFP和RFP后作为疫苗生产毒株 用于制备伪狂犬病活疫苗。
[0016] 6.权利要求1所述的伪狂犬病病毒株的应用，其特征在于rPRV/gE/gl / US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/RFP+株作为活载体病毒插入一种和/或多种动物病原抗原基因， 以获得表达外源基因的重组病毒，制备基因工程活载体疫苗，达到同时防制多种疾病的目 的。
[0017] 本发明技术路线如下：
[0018] 1.通过基因克隆技术以PRV(SX株）部分US6和US2基因序列作为同源臂，以及 绿色荧光蛋白基因 GFP作为筛选标记构建转移载体pMD-US6-GFP-US2,将PRV(SX株）病毒 和转移载体共转染PK15细胞获得缺失gE、gl和US9基因，同时插入GFP标记的重组病毒 rPRV/gE /gl /US9 /GFP+〇
[0019] 2.以PRV SX株的UL49. 5基因为模板，构建两个克隆载体pMD18T-A 37-40和 pMD18T-CT-null，分别缺失UL49. 5中胞外域37-40氨基酸基因序列和胞质尾区（CT)80-96 氨基酸，并将缺失了这两部分的基因片段通过引入酶切位点AflII进行连接，构建含有CT 基因两端部分基因序列的同源臂的转移载体PMD-UL50-UL49. 5- Λ 37~40-CT-RFP-UL49， 将rPRV/gE /gl /US9 /GFP+病毒和转移载体共转染ΡΚ15细胞获得缺失gE、gl、US9、部分 UL49. 5基因（37-40氨基酸基因序列和CT基因序列）的缺失病毒，获得同时插入RFP标记 的重组病毒rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/GFP+/RFP+。再通过同源重组将RFP缺失，最终筛 选 rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/GFP+缺失病毒。
[0020] 3.以TK基因两测的UL24和UL22部分基因序列为同源臂，以红色荧光蛋白 基因（RFP)作为筛选标记构建转移载体pMD-UL24-RFP-UL22，将其与rPRV/gE /gl / US9 / Λ UL49. 5/GFP+病毒共转染PK15细胞获得缺失TK基因同时插入RFP标记的重组病 毒 rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/RFP+。
[0021] 4.对重组病毒 rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/RFP+进行生物特性分析， 试验结果表明该重组病毒能在PK15细胞上稳定遗传，对小鼠安全，与未缺失UL49. 5部分基 因序列的重组病毒rPRV/gE /gl /US9 /TK /GFP+/RFP+相比，在PK15细胞上出现病变的时间 提前8小时左右
【具体实施方式】
[0022] 1.载体
[0023] PMD-18T载体，用于克隆测序及转移载体的构建，购自宝生物工程（大连）有限公 司。含有GFP基因的载体pU-EGFP和含有RFP基因的载体pU-ERFP，均由专利申请人所在实 验室保存。
[0024] 2.引物设计
[0025] 根据GenBank上发表的PRV序列设计合成以下引物：
[0026] (1)扩增gl基因左同源臂：
[0027] US6F :5' -GACTTAAGGATCTCCGACCCGCAGGTGG-3'（序列 1)
[0028] US6R :5' -GACTTAAGGGAGCCGGGTCACGTCGCGC G-3'（序列 2)
[0029] (2)US9基因右同源臂：
[0030] US2F :5' -GACTAGTATGGGGGTGACGGCCATCAC-3'（序列 3)
[0031] US2R :5' -GACTAGTCGGAGAGATCCTGCCGTCTAGG-3'（序列 4)
[0032] (3) GFP 基因：
[0033] EGFP-F :5' -GGTATACGGATCCAAGGAGATATAACA-3'（序