胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料、制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及高分子化学、有机合成以及生物材料技术领域，具体涉及一种基于胍 基取代的芳香化合物修饰的高分子材料及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 基因转染是指将具有生物功能的核酸导入到细胞内并使核酸在细胞内表达其生 物功能的过程。在这个过程中，高分子材料扮演了重要的角色。早期的转染方法是利用磷 酸钙进行转染，然而这种方法的效率很低，且对很多种细胞无效，不能满足很多科研工作的 要求。因此为了提高基因转染效率，开发了两大类的载体：病毒类载体和非病毒类载体。利 用病毒转染方法可以获得高效基因转染效果，但病毒类载体存在细胞株适用性，携带基因 能力有限，容易引起细胞免疫反应，存在安全隐患等问题。因此对非病毒类高分子材料一阳 离子脂质体、阳离子聚合物以及其经过修饰所得到的载体进行了广泛的研究。
[0003]聚酰胺-胺树形高分子（polyamidoamine，PAMAM)是TomaliaD.A.于 1985 年首 次报道的具有几何分支的椭圆形结构的树形大分子。其高效低毒安全的特点已经在基因转 染中被广泛研究和应用，得到了人们的广泛关注。1993年，Meijer等用外向发散法合成聚 丙稀亚胺（Polypropyleneimine，PPI)树形高分子，首次实现了大规模合成和商业化，为树 形高分子的广泛研究和应用奠定了基础。树形高分子的特殊结构使其易于结合基因质粒 片段，并且其内部三级胺结构可以起到"质子海绵"的作用，促进其在细胞内涵体的逃逸行 为，有效地确保目的基因在细胞内的稳定性。近年来，将聚酰胺-胺、聚丙烯亚胺、聚赖氨酸 树形高分子以及聚乙烯亚胺阳离子高分子表面氨基进行化学修饰成为主要修饰形式之一。 例如在表面氨基上共价连接疏水基团、氨基酸，可以获得相对较好的基因转染效果。其中， 在阳离子高分子表面氨基修饰疏水基团，例如修饰脂肪链可以有效地提高材料的抗血清能 力，增强材料的膜融合能力、细胞摄入能力和细胞内的核酸释放能力。此外修饰了脂肪链 的阳离子高分子还可以通过窖蛋白介导的内吞途径进入细胞。因此疏水修饰广泛应用于 提高高分子材料的基因转染效果。阳离子高分子表面修饰氨基酸，例如精氨酸或赖氨酸， 也能够有效地提高阳离子高分子的基因转染效果。精氨酸富含胍基基团，胍基基团能够和 细胞膜相互作用，富含精氨酸的肽链可以直接作为基因转染载体。胍基基团能够通过静电 力和氢键两种力的相互作用有效的结合磷酸根，从而提高树形高分子结合细胞膜的能力。 但是通过在树形高分子表面氨基和胍基之间引入不同长度的连接键证明：连接键在胍基和 细胞膜相互作用中具有重要作用，不同的连接键会导致树形高分子在细胞中的摄入能力不 同。研究结果充分说明了胍基基团只有和恰当的连接键相连才能充分发挥其作用。以第五 代聚酰胺胺树形高分子表面修饰精氨酸为例，精氨酸能够有效的提高树形高分子的转染 效率。但是精氨酸修饰对树形高分子的转染能力提高有限，无法和广泛使用的商业化试剂 Lipofectamine2000(Lipo2K)相比。研究结果表明精氨酸修饰中连接胍基和树形高分子 表面氨基的连接键并不是最佳的连接方式。
[0004] 苯基作为一种疏水基团连接在树形高分子表面的氨基上，能够增加树形高分子的 疏水性，有利于树形高分子穿过细胞膜的疏水脂双层。但是由于树形高分子和细胞膜之间 主要通过静电力相互作用，树形高分子表面氨基修饰苯甲酸后虽然增加了材料的疏水性， 却也同时削弱了树形高分子表面的正电荷，因此树形高分子表面氨基修饰苯甲酸，不能有 效的提高树形高分子的转染效率。因此在苯基上连接功能基团成为一种非常重要的提高树 形高分子转染能力的方式。
[0005] 已知的基于脂肪链或精氨酸修饰的高分子材料的较高的细胞毒性、较低的转染效 果以及细胞株的选择性，是制约这些材料在生物医学领域广泛应用的主要因素。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中的缺陷，获得具有更好的转染效果以及生物相容性的载体， 本发明提出了一种胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料及其制备方法，即基于胍基取 代的芳香化合物表面化学共价修饰的高分子材料及其制备方法。本发明的合成方法高效、 安全，合成步骤简洁，获得的高分子材料细胞毒性较小，且能在多种难转染的细胞中具有高 转染效率。并且所制备的高分子材料不论是DNA转染还是RNA转染都和商业化转染试Lipo 2K相当甚至超越商业化转染试剂，更值得人注意的是在蛋白转染中，所制备的材料的转染 效率远超过商业化转染试剂Lipo2K。
[0007] 本发明提供了一种胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料，即基于阳离子高分 子和胍基取代的芳香化合物的高分子材料，包括阳离子高分子骨架和胍基取代的芳香化合 物功能基团，所述胍基取代的芳香化合物功能基团共价连接在所述阳离子高分子骨架表 面。
[0008] 其中，所述胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料的结构如式（1)所示：
[0009]
[0010] 式⑴中：
[0011] R为阳离子高分子骨架；
[0012] Y为连接键；
[0013] X为 1-1024 的整数。
[0014] 其中，所述R为如（8)所示的聚酰胺-胺树形高分子、如式（9)所示的聚丙烯亚胺 树形高分子、如式（10)所示的聚赖氨酸树形高分子、如式（11)所示的支化聚乙烯亚胺或 如式（12)所示的线性聚乙烯亚胺；
[0015]
[0016]其中，式（8)、式（9)、式（10)中：
[0017] Μ是阳离子高分子的核心，包括氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、葵二胺和1， 12-十二烷二胺；
[0018] η是1-10的整数；
[0019] m是2-4的整数；
[0020] 式（11)和式（12)中：
[0021] y和z是1-5117的整数。
[0022] 其中，所述Y如式（13)、式（14)、式（15)、式（16)、式（17)或式（18)所示：
[0024]式（17)中：
[0025]k为1-20的整数。
[0026] 本发明还提出了一种高分子材料，其结构如式（1)所示；其中，所述R为如式（8) 所示的聚酰胺-胺树形高分子；所述Y为如式（13)所示的酰胺键；所述X为1-1024的整数 倍；
[0027]
[0028]式（8):
[0029]Μ是聚酰胺-胺树形高分子的核心，包括氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二 胺和1，12-十二烧二胺；
[0030] η是1-10的整数；
[0031] m是2-4的整数。
[0032] 其中，所述高分子表面为伯胺基团或仲胺基团。
[0033] 本发明还提出了一种胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料的制备方法，将胍 基取代的芳香化合物和阳离子高分子溶解于有机溶剂中，加入一定量的催化剂和碱，在室 温下搅拌充分反应，除去未反应的胍基取代的芳香化合物以及相关溶剂，即得到所述的胍 基取代的芳香化合物修饰的的高分子材料，所述高分子材料结构如式（1)所示。本发明制 备方法是通过将胍基取代的芳香化合物共价连接到阳离子高分子表面上，即阳离子高分子 的伯胺基团或仲胺基团与胍基取代的芳香化合物通过化学反应相连，从而制备得到如式 (1)所示的高分子材料。
[0034] 其中，所述制备方法中，所述催化剂选自：二环己基碳二亚胺，N-羟基琥珀酰亚 胺。
[0035] 所述碱为三乙胺。
[0036] 所述有机溶剂选自：二甲基亚砜，N，N_二甲基甲酰胺。
[0037] 本发明还提出了胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料作为核酸或蛋白分子 的输送载体的应用。其中胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料如式（1)所示，其在体 外作为核酸或蛋白分子的输送载体。其中，所述核酸包括DNA、siRNA、shRNA、micoRNA或修 饰的核酸；所述蛋白为肽、修饰的肽、蛋白或修饰的蛋白。
[0038] 本发明还提出了一种新的复合物，其包括如式（1)所示的胍基取代的芳香化合物 修饰的高分子材料、核酸或蛋白；其中，在该复合物中，由所述高分子材料携带所述核酸或 蛋白。
[0039] 在一个具体的实施例中，在室温下，将胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料 和绿色荧光蛋白质粒或荧光素酶质粒或siRN