一种快速检测丝状真菌合成低聚果糖能力的平板显色方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测丝状真菌合成低聚果糖能力的方法，属于检测技术领域。具体地 说是涉及一种快速检测丝状真菌合成低聚果糖能力的平板显色方法。
【背景技术】
[0002] 低聚果糖(Fructo-oligosaccharides，简写为F0S)又称功能性果寡糖，是一种典 型的益生元物质，广泛存在于洋葱、菊芋、香蕉、梨、小麦和蜂蜜等天然产物中，目前在国内 外已被广泛地应用于药品、食品、保健品、饲料等产品的开发和生产中。其分子式为G-F-Fn (G为葡萄糖，F为果糖，n=l~3)，是蔗糖分子上以β-1，2糖苷键结合数个D-果糖所形成的蔗 果三糖(GF2)、鹿果四糖(GF3)、蔗果五糖(GF4)及其混合物的总称，结构式如下。
[0004]低聚果糖甜度是蔗糖的0.3-0.6倍，既保持了蔗糖的纯正甜味性质，又比蔗糖甜味 清爽。低聚果糖具有重要的生理学功能:促进肠道益生菌如双歧杆菌的增殖、减少和抑制肠 内腐败物质的产生、降低胆固醇和甘油三酯水平、促进人体内维生素B族合成及钙离子吸收 等，同时又具有低热值、防龋齿、提高免疫力和抗病力等功能，所以近年来人们对低聚果糖 的关注和需求与日倶增。
[0005]人们对低聚果糖的大量需求，使得低聚果糖产业得以发展。但是天然蔬菜和水果 中低聚果糖含量非常有限，不利于提纯和生产，因此，工业上一般采用具有低聚果糖合成酶 活性（果糖基转移酶，Fructosyltransferase，FTase，EC2 · 4 · 1 · 9 ;β_咲喃果糖苷酶，0_ fructofuranosidase，Ffase，EC3.2.1.26)的微生物进行发酵，以鹿糖为原料合成具有高 附加值的低聚果糖。酶法合成过程中，一分子蔗糖作为供体，一分子蔗糖作为受体，酶作用 于供体蔗糖断裂α-l，2糖苷键生成果糖基和葡萄糖，果糖基在转移酶作用下以β-l，2糖苷键 形式连接到受体蔗糖分子上形成蔗果三糖，以此方式继续生成蔗果四糖和蔗果五糖，每添 加一分子果糖基的同时释放出一分子葡萄糖。所以，葡萄糖含量的多少间接反映了微生物 合成低聚果糖能力的强弱。相关文献报道，具有低聚果糖合成酶活性的微生物包括丝状真 菌、酵母和细菌，其中具有低聚果糖合成酶活性的丝状真菌较为普遍，包括黑曲霉 (Aspergillusniger)、日本曲霉（Aspergillusjaponicus)、棘抱曲霉（Aspergillus aculeatus)、米曲霉（Aspergillusoryzae)、出芽短梗霉（Aureobasiumpullulans)等十几 种，但其仅有少数几种产生的低聚果糖合成酶能够应用于工业上大量生产低聚果糖，因此， 加快低聚果糖产业发展的研究重点是进一步筛选具有较高低聚果糖合成酶活性的优良丝 状真菌。
[0006]目前，检测和比较丝状真菌合成低聚果糖能力的方法主要有:3，5-二硝基水杨酸 法(DNS法）、薄层层析分离法(TLC法)和高效液相色谱法(HPLC法)等。这些方法操作过程复 杂、耗时长且成本高(如色谱法），大大减缓了工业用生产低聚果糖丝状真菌的筛选进程。所 以，研发一种能够快速衡量丝状真菌合成低聚果糖能力的检测方法甚为关键。经检索，有关 基于培养基平板并利用双酶法定性检测葡萄糖的产生而间接反映丝状真菌合成低聚果糖 能力的检测方法在相关专利和文献中还未见报道。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术述的不足，本发明的目的是提供一种快速检测丝状真菌合成低聚果 糖能力的平板显色方法。
[0008] 本发明所述快速检测丝状真菌合成低聚果糖能力的平板显色方法，步骤是：
[0009] (1)将待测的丝状真菌新鲜孢子分别用无菌生理盐水稀释至IX107~108个/mL，制 得丝状真菌孢子悬液备用；其中所述丝状真菌是：黑曲霉(Aspergi1lusniger)、塔宾曲霉 (Aspergillustubingensis)和/或棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus);同时，将工业用黑 曲霉XG530菌株作为本检测丝状真菌合成低聚果糖能力平板显色方法的标准菌株，以相同 实验条件制备孢子悬液备用；
[0010] (2)分别取步骤（1)制备的丝状真菌孢子悬液及标准菌株孢子悬液ΙμL，点种于察 氏固体培养基的平板上，其中各菌株孢子之间点种距离不小于2cm，在30±3°C培养5~10小 时；
[0011] (3)配制葡萄糖检测液，直接倒在步骤(2)培养后的长有菌落的平板上，并使其均 匀覆盖平板上的所有培养基表面，然后40±5°C静置10~20min，观察菌落周围形成的红色 晕圈，比较待测菌株与标准菌株形成的红色晕圈的大小，若红色晕圈比标准菌株形成的大 即可判定该待测菌株合成低聚果糖能力强，若红色晕圈比标准菌株形成的小即可判定该待 测菌株合成低聚果糖能力弱；其中，所述葡萄糖检测液的配方是：葡萄糖氧化酶(G0D)4~ 6U/ml，过氧化物酶(P0D)0.2~0.4U/ml，4_氨基安替吡啉(4-AAP)0.lmg/ml，苯酚lmg/ml，琼 脂粉0.007g/ml。
[0012] 上述快速检测丝状真菌合成低聚果糖能力的平板显色方法中，步骤(2)所述培养 温度优选为30°C，培养时间优选为5小时。
[0013]上述快速检测丝状真菌合成低聚果糖能力的平板显色方法中，步骤(3)所述葡萄 糖检测液的配方优选是:葡萄糖氧化酶(G0D)5U/ml，过氧化物酶(P0D)0.3U/ml，4_氨基安替 P比啉(4-AAP)0.lmg/ml，苯，琼脂粉0.007g/ml。
[0014] 本发明所述的检测丝状真菌合成低聚果糖能力的平板显色方法是依据酶法合成 低聚果糖的原理，在以蔗糖(葡萄糖-α_1，2-果糖)为底物催化生成低聚果糖时，每进行一次 转糖基反应就会生成一分子葡萄糖（图2)，即葡萄糖的含量可间接地反映低聚果糖的生产 量。因此，在以蔗糖为唯一碳源的菌体生长平板上利用双酶法定性检测葡萄糖含量可以间 接反映菌体利用蔗糖和合成低聚果糖水平的强弱。双酶法的检测机理是:首先，利用葡萄糖 氧化酶(GOD)将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，生成过氧化氢，然后，利用过氧化物酶(POD)将过氧 化氢分解为水和氧，同时使色原性氧受体4-氨基安替吡啉(4-AAP)和苯酚去氢缩合为红色 醌类化合物，所以菌落周围红色晕圈的大小直接反映了葡萄糖含量的高低。
[0015]本发明所述的观察菌落周围形成的红色晕圈，比较待测菌株与标准菌株形成的红 色晕圈的大小，若红色晕圈比标准菌株形成的大即可判定该待测菌株合成低聚果糖能力 强，若红色晕圈比标准菌株形成的小即可判定该待测菌株合成低聚果糖能力弱的结论进一 步经3,5_二硝基水杨酸法(DNS)和薄层层析分离法(TLC)分析得以证实，根据测定果糖基转 移酶活力和定性分析合成的低聚果糖成分、含量的结果表明，产红色晕圈大于标准菌株的 待测丝状真菌对应的果糖基转移酶活力和合成低聚果糖的含量明显处于较高水平。
[0016]本发明公开了一种基于培养基平板上利用双酶法定性检测葡萄糖的产生而间接 反映丝状真菌合成低聚果糖能力的检测方法。该方法的有益效果是:此方法巧妙地将低聚 果糖合成过程产生葡萄糖和酶法快速检测葡萄糖两方面结合，实现了在以蔗糖为唯一碳源 的固体培养基上利用菌落产红色晕圈大小的不同进行低聚果糖合成菌株能力高低的比较， 解决了现有检测技术中费时、工作量大、成本高的缺陷。
[0017]本发明公开的方法快速、方便，具有较强的应用和推广价值，尤其是在工业用低聚 果糖生产菌株的选育方面，可以快速的实现丝状真菌低聚果糖合成能力的比较，极大的缩 短了高产低聚果糖丝状真菌的筛选进程，推动低聚果糖的工业化生产。
【附图说明】
[0018]图1.确立检测标准菌株合成低聚果糖能力的平板显色最佳时间
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