>[0048] 图11是中性内切木聚糖酶XYN-H31基因电泳图；其中：泳道Μ为takara公司的 DL2000Marker;泳道 1 为 XYN-H31 基因的PCR 结果。
[0049] 图12是中性内切木聚糖酶XYN-H31蛋白电泳图；其中：泳道Μ为Marker，takara公司 protein ladder;泳道1为无 IPTG诱导细胞破碎液上清;泳道2为ImM IPTG诱导细胞破碎液 上清;泳道3为Ni柱纯化的重组目的蛋白。
[0050] 图13是中性内切木聚糖酶XYN-H31最适反应pH的结果图。
[00511图14是中性内切木聚糖酶XYN-H31最适反应温度的结果图。
[0052]图15是中性内切木聚糖酶XYN-H31pH稳定性的结果图。
[0053]图16是中性内切木聚糖酶XYN-H31温度稳定性的结果图。
【具体实施方式】
[0054]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0055] 下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制 造厂商所建议的实验条件。
[0056] 实施例1
[0057] (一)材料
[0058] 1、菌种:嗜碱链霉菌，为Streptomyces sp.H31。所述菌株保藏单位：中国典型培养 物保藏中心(CCTCC)，保藏时间：2015年1月5日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号： CCTCC Ν0:Μ 2015003;该菌株已经在专利"201510034112.3、一种嗜碱链霉菌及其产生的中 性内切葡聚糖酶和应用"中公开。E.coli T0P10F'购自Invitrogen公司；
[0059] 2、载体:大肠杆菌克隆载体pMDlS-I1购自大连宝生物公司，大肠杆菌表达载体pET- 28a( + )(Novagen，KanR)购自Novagen公司；载体图谱见图1，其多克隆位点图见图2。
[0060] 3、培养基
[0061 ] (1)选择培养基：木聚糖8.(^/1，咖031.(^/1，]\%3〇4.7!1 20 0.58/1，他(：1158/1， KH2P0U · 5g/L，固体培养基加琼脂15~20g/L，pH 9 · 0;
[0062] (2)LB培养基:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，固体培养基加琼脂 15~20g/L，pH 9.0，121°C高压灭菌20min。
[0063] 4、主要试剂：DNA聚合酶、DNA分子量标记为宝生物公司产品；Lysozyme (DNase RNase non_detected，>70，000U/mg)、一步法快速制备感受态细胞试剂盒(SSCS)为上海生 工生物工程公司产品。PCR引物合成由上海生工完成，DNA序列测定由Invitrogen公司完成； 基因提取试剂盒、PCR产物片段纯化试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒为Omega公司产 品。
[0064] 5、仪器：Thermal cycler PCR仪为Applied Biosystems By Life Technologies 公司、DNA电泳系统为Bio-rad公司产品；分光光度计及微量分光光度计为Pharmacia Biotech公司产品；Thermomixer comfort温控振荡仪、移液枪、台式离心机为Eppendorf公 司产品；低温高速离心机为Sigma公司产品;Dolphin-DOC凝胶成像系统为美国WEALTEC公司 产品；恒温摇床及恒温水浴锅为WAGEN公司产品。
[0065](二)实验方法和结果 [0066] 1、基因组DNA的提取
[0067] 在37°C、220r/min摇瓶培养Streptomyces sp ·Η31菌，72h后离心收集菌体，然后利 用The E.Z.N.A Bacterial DNA Kit试剂盒提取基因组总DNA。其基本步骤如下：
[0068] (a)培养基接种Streptomyces sp.H31菌，放入温控摇床中，于37°C，220rpm摇瓶培 养48h后取出分装备用。（b)将3mL Streptomyces sp.H31菌液在室温条件下8000rpm离心 lOmin; (c)弃去上清液，保留沉淀，然后加入180yL TE buffer重悬菌体，再加入20yL50mg/ mL溶菌酶溶液30°C条件下水浴lOmin; (d)水浴完成后在室温条件下8000rpm离心5min，去掉 上清，加入200yL BTL buffer，短暂祸旋；（e)加入25~40mg玻璃珠，高速祸旋5min; (f)加入 25yL蛋白酶K溶液，短暂涡旋，然后55°C水浴60min; (g)加入5yL RNaseA溶液，反复颠倒，然 后室温放置5min; (h)室温条件下12000rpm离心5min，吸取上清到另外一个干净的离心管 中，避免吸到沉淀；（i)加入220yL BDL buff er，短暂涡旋，然后65°C水浴lOmin; (j)加入220 yL无水乙醇，高速涡旋20s，然后将混合液转移到套有2.0mL收集管的Akibaiin Column中， 12000rpm离心lmin; (k)弃去收集管中的液体，加入500yL的HB buffer，然后lOOOOrpm离心 lmin; (1)弃去收集管中的液体，加入700yL的DNA Wash 131^€61'，然后10000印111离心1111；[11; (110重复加入70(^1^的0嫩￥3811131^€61'，然后10000印1]1离心1111；[11;(11)弃去收集管中的液体， 再用12000rpm离心2min以除尽剩余的Wash buffer; (h)将Akibaiin Column放入一个洁净 的EP管中，然后在Akibaiin Column膜的中央处加入50~100yL的Elution Buffer，室温放 置2min，1 OOOOrpm离心lmin将DNA抽提下来。
[0069]采用1%琼脂糖凝胶电泳对提取产物进行检测。结果如图3所示，能看到一条较为 明显的条带，所用DNA Ladder Marker最大条带为15,000bp，基因组条带在Marker最大条带 之上，说明其大小超过15,000bp，符合基因组大小要求。
[0070] 2、TouchDown PCR克隆木聚糖酶基因保守序列
[0071 ] (1)使用PrimerPremier 5.0软件设计上下游引物。根据已知的第10家族木聚糖酶 保守序列设计上游简并引物XYN-H31 JBUP(5 ' -GACTGGGAYGTNGTNAATGA-3 '）和下游简并引物 XYN-H31 JBD0WN( 5 ' -CTCTGGAAGCCNAYNCMRTSNA-3 '），送去合成。
[0072] (2)使用Takara的PCR Amplification Kit试剂盒，以基因组DNA为模板，按照如下 反应体系配制PCR反应液： cldH20 14l(L； IOxPCR BuiTcr 2.5.uL； dNTP Mixture 2μL； 丨物 XYN-H31JBUP 2μ?';
[0073] n 引物 XYN-H31JBDOWN 2μΙ^ 模板 2 μι.； Ex Taq lW 〇.5μL,: Total 25pL/Sample ( }.]_:晶）》
[0074] 然后按照以下条件进行Touchdown PCR反应：
[0075] 94? 5min；
[0076]
[0077] 采用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。结果如图4所示。在泳道4中，有一条 大小约为250bp的条带，符合已知的10家族木聚糖酶基因保守序列大小，所以对该条带进行 回收。
[0078] 3、Touchdown PCR产物回收
[0079] PCR产物回收使用的是Omega公司生产的Gel Extraction Kit(100)D2500-01，主 要步骤如下：（1)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体， 此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，减小凝胶体积，提高DNA回收率，之后放入EP 管中。（注意切胶时不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤）（2)切碎胶块。胶块 切碎后可以加快操作步骤(3)的胶块融化时间，提高DNA的回收率。称量胶块重量，计算胶块 体积。计算胶块体积时，以lmg= lyL进行计算，向胶块中加入等量的胶块融化液Binding Buffer。（ 3) 50°C溶解7~15min，保证溶胶要完全，否则会影响后续回收。（4)将溶胶放入层 析柱中（不超过700yL)，12，OOOrpm离心lmin，倒掉收集管中的液体。（5)加入300yL的 Binding Buff er，12，OOOrpm 离心 lmin，倒掉收集管中的液体。（6)加入 700yL的SPW，12， OOOrpm离心lmin，倒掉收集管中的液体。（7)重复步骤(6)。（8)将空柱13,000印111离心211^11， 以去掉残存的乙醇，否则会严重影响后续DNA的回收。（9)弃掉收集管，换成干净的EP管，往 吸附柱正中间的吸附膜小心加入15yL Elution Buffer，室温静置3min，13，000rpm离心 2min，不立即用的话保存于-20°C冰箱中。
[0080] 4、感受态细胞制备
[0081 ] 感受态细胞的制备使用TaKaRa公司的Competent Cell Prepatation Kit试剂盒 制备，步骤如下：
[0082] (1)用接种针挑取大肠杆菌在LB固体培养基上分级划线，以能够出现单菌落为宜， 37°C过夜培养。
[0083] (2)挑取菌落置于含20mL液体LB培养基的三角烧瓶中，37°C、220rpm培养。
[0084] (3)测定0D值，当0D600值达到0.35~0.5时，放置冰中停止培养，若0D值超出此范 围将不能保证感受态细胞的转化效率。
[0085] (4)取lmL上述菌液于1.5mL EP管中，4,000rpm、4°C离心5min，弃上清（尽量除去上 清)。
[0086] (5)在每个EP管中加入100yL冰中预冷的Solution A，轻轻弹动EP管使沉淀悬浮， 禁止剧烈振荡，4,000rpm、4°C离心5min，弃上清(尽量除去上清）。