加入等体积的苯酸:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，充分混合，4°C 12000rpm离心5min，取上清至新的离心管中；
(4)加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，充分混合，4°C12000rpm离心5min，取上清至新的离心管中；
(5)加入2倍体积的无水乙醇，再加入1/10体积NaAC(pH 5.2)轻轻颠倒，充分混匀，-20°(3冰箱静置lOmin;
(6)12000rpm离心5min，弃上清，加入500μ170%乙醇溶液，轻轻颠倒离心管数次，12000rpm离心2min，弃上清；
(7)重复(6)—次，
(8)充分干燥DNA沉淀，加ΙΟΟμΙ DNase/RNase-Free Distilled Water 溶解DNAq-20
°c保存。
[0020]dNTP为脱氧核糖核苷三磷酸的缩写，N是指含氮碱基，代表变量指代A、T、G、C等，是包括dATP，dGTP, dTTP, dCTP等在内的统称，在生物DNA合成中，以及各种PCR中起原料作用。
[0021 ] 10 X Isothermal Amplificat1n反应缓冲液为10倍等温扩增的反应缓冲液。
[0022]荧光染料Calcein为荧光染料钙黄绿素。
[0023]荧光染料SYT09是饱和荧光染料，最大激发光为483nm，最大发射光为503nm。
[0024]DNase/RNase-Free Distilled Water为DNA酶/酶的蒸饱水。
[0025]与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明基于环介导等温扩增技术LAMP法，根据靶基因设计的四条引物能特异性识别靶基因序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎一环DNA混合物。采用4条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在60?65°C对核酸进行扩增反应，反应需在恒温条件下进行，反应时间依据模板DNA质量变化，一般为90min或更少，在45?90min的短时间内扩增效率可以达到109?101Q个拷贝。加入模板DNA，在60?65°C反应45?90min后，在80°C保温2min，终止反应。在反应中，有核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中Mg离子结合，产生副产物焦磷酸镁的白色沉淀。
[0026]本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点。具体描述如下:
(1)快速高效:整个扩增只用45?90min即可完成，扩增产量可达109?101Q个拷贝；
(2)操作简便:不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部实时荧光检测仪就能反应和检测，条件比较温和；
(3)高特异性:本发明根据耐除草剂大豆DP-356043的特异内源基因处设计了四条特异性引物，应用上述四条引物，扩增靶序列的6个区域，具有很强的品系特异性，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
(4)高灵敏度:最低检测极限可达到100个拷贝；
(5)鉴定简便:可通过观察加入Calcein颜色变化、是否存在焦磷酸镁沉淀或是否出现“S”型扩增曲线来判断扩增与否，无需电泳等其它任何分析步骤，适合现场检测。
【附图说明】
[0027]图1是实施例1的显色检测结果图(1:阳性对照;2-5:待检样品；6:阴性对照)；
图2是实施例1的扩增检测结果图(1:阳性对照;2-5:待检样品；6:阴性对照)；
图3是实施例2的扩增检测结果图(1:阳性对照;2-5:待检样品；6:阴性对照)；
图4是实施例3的扩增检测结果图(1:阳性对照；2-7依次为:3%、0.3%、0.8%、0.03%、0.08%,0.003%的样品DNA; 8:阴性对照)；
图5是实施例4的扩增检测结果图(1-19依次为:耐除草剂大豆DP-356043、RoundupReady GTS 40-3-2、A2704-12、A5547_127、DP305423、DP56423、M0N89788、CV127，转基因玉米M0N810，转基因水稻BT63，转基因土豆EH92-527-1，转基因棉花M0N531，转基因油菜T45，非转基因大豆、水稻、小麦、玉米、棉花，去离子水。
【具体实施方式】
[0028]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0029]实施例1含显色剂的试剂盒及检测方法
一种的LAMP检测试剂盒，包括引物液、反应液、DNA聚合酶、对照和显色剂:
(1)引物液:含有50μΜ外引物1、50μΜ外引物2，50μΜ内引物1、50μΜ内引物2，四条引物为: 外引物1:CATAACCTCATCTCGCCTT(SEQ ID No:l)；
外引物2:CAATGGAATCCGAGGAGG(SEQ ID No:2)；
内引物1:AACCTAGCCTATTCGACCTAACGGAGCCATCGTAGGAGAA C(SEQ ID No:3)；
内引物2:TAGAGATCCGTCAACATGGTGGTTGGTCTTCTGAGACTGT ATCCSEQ ID No:4)。
[0030](2)反应液:含有 12mM dNTP、10 X Isothermal Amplificat1n反应缓冲液、150mMMgS04水溶液，三者的体积比是8:5:2；
(3)DNA聚合酶:BstDNA聚合酶，浓度为8U/yl ；
(4)对照:含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；
(5)显色剂:荧光染料Calcein。
[0031]用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测:
1)待检样品DNA的提取:采用CTAB法提取纯化待测样品DNA；
2)恒温检测反应:在200μ1PCR管配制反应体系:引物液1.8μ1，反应液15.2μ1，DNA聚合酶Ιμ?，待检DNA 1 ?6μ1，用DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25μ1;设置阳性对照反应时，用含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA;将配制好的PCR管混匀后离心，并于60?65°C反应45?90min，并在80°C持续2min ；
3)结果判断:在上述反应管中加入2μ1显色剂，混匀，若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。
[0032]本实施例中，阴性对照显现橙色，阳性对照显现绿色，待测样品1、2的PCR管显绿色(图1中管阳)，表明待测样品1、2中含有耐除草剂大豆DP-356043，待测样品3、4的PCR管显橙色(图1中管阴)，表明待测样品3、4中不含耐除草剂大豆DP-356043。
[0033]一种耐除草剂大豆DP-356043的LAMP检测试剂盒，包括引物液、反应液、DNA聚合酶、对照和荧光指示剂:
(1)引物液:含有50μΜ外引物1、50μΜ外引物2，50μΜ内引物1、50μΜ内引物2，四条引物为: 外引物1:CATAACCTCATCTCGCCTT(SEQ ID No:l)；
外引物2:CAATGGAATCCGAGGAGG(SEQ ID No:2)；
内引物1:AACCTAGCCTATTCGACCTAACGGAGCCATCGTAGGAGAA C(SEQ ID No:3)；
内引物2:TAGAGATCCGTCAACATGGTGGTTGGTCTTCTGAGACTGT ATCCSEQ ID No:4)。
[0034](2)反应液:含有 12mM dNTP、10 X Isothermal Amplificat1n反应缓冲液、150mMMgS04水溶液，三者的体积比是8:5:2；
(3)DNA聚合酶:BstDNA聚合酶，浓度为8U/yl ；
(4)对照:含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；
(5)荧光指示剂:SYT0-9。
[0035]用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测:
1)待检样品DNA的提取:采用CTAB法提取纯化待测样品DNA；
2)恒温检测反应:在200μ1PCR管配制反应体系:引物液1.8μ1，反应液15.2μ1，DNA聚合酶lyl，SYT0-9 Ιμ?，待检DNA 1 ?6μ1，用DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25μ1;设置阳性对照反应时，用耐除草剂大豆DP-356043的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA;将配制好的PCR管混匀后离心，并于LineGene 9640 qPCR仪上60?65°C反应45?90min，并在80°C 持续 2min;
3)结果判断:根据是否出现“S”型扩增曲线判断扩增结果，若显现“S”型扩增曲线则为阳性，若没显现“S”型扩增曲线则为阴性。
[0036]本实施例中，阴性对照显现“直线”扩增曲线，阳性对照显现“S”型扩增曲线，待测样品1、2的显现“