与家蚕核型多角体病毒感染相关的microRNA的应用
【技术领域】
[00011本发明涉及家蚕microRNA，尤其涉及一种与家蚕核型多角体病毒感染相关的 mi croRNA的应用。
【背景技术】
[0002] 家香核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)属昆虫杆状 病毒科(1^(3111〇￥；[1^(1&6)，核型多角体病毒属(1'|11(316(^017116(11'0￥；[1'118)，病毒粒子为杆状， 基因组大小约为128kb，编码约100多个基因。该病毒传染性极强，难以控制，暴发频繁，给养 蚕业造成了巨大的经济损失。在宿主昆虫细胞内，BmNPV DNA的复制及基因的表达是一种有 序发生的级联事件，其感染过程依赖于其基因的阶段性调节和依次表达，即前一阶段的基 因产物直接或间接的反式作用于下一阶段的基因转录。病毒感染早期，转录激活因子可以 诱导杆状病毒基因的表达并选择性的调控特定种类的宿主基因的表达从而建立感染。感染 晚期阶段主要是病毒DNA的复制和结构基因的表达。
[0003] MicroRNA是一类小的非编码RNA，广泛存在于动物、植物和病毒等生物中。RNA干扰 (RNA interference)作为一种先天的抵抗病毒感染的防御机制最早是在植物中发现的，随 后发现，RNA干扰在昆虫自身免疫体系中也扮演着重要角色。microRNA广泛参与包括生长发 育、细胞凋亡、肿瘤、抗病毒等一系列重要的生命过程。研究表明，宿主编码的microRNA在受 到病毒感染后，其表达水平会发生显著变化。差异表达的microRNAs可能是由宿主免疫应答 反应引起或由病毒感染诱导的调控因子导致。另一方面，病毒编码的miRNA也可调控自身与 病毒复制相关基因或宿主免疫相关基因，从而进一步增加了宿主-病毒互作的复杂性。
[0004] 目前，与家蚕核型多角体病毒感染相关的microRNA研究较少，因此本领域需要鉴 定出相关microRNA或者对已知microRNA功能及用途进行研究，为研究家蚕与核型多角体病 毒的互作机制提供基础，同时为家蚕核型多角体病毒的检测及防治提供新的思路。
【发明内容】
[0005] 发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明开拓了家蚕microRNA特别是bmo-miR-277-5p的新用途。
[0006] 本发明通过以下技术方案予以实现：
[0007] 本发明提供了 bm〇-miR-277-5p在制备检测家蚕核型多角体病毒感染的试剂盒中 的应用。
[0008] bm〇-miR-277_5p为家香(Bombyx mori)的一种microRNA，与家香核型多角体病毒 感染紧密相关，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，GenBank登录号为LM381765.1。实验证 明，bm〇-miR-277-5p在感染BmNPV的家蚕中的表达水平显著高于正常家蚕中的表达水平。因 此，可利用bm〇-miR-277_5p，制备试剂盒，通过检测bm〇-miR-277_5p的表达水平，判断家蚕 是否被BmNPV所感染。
[0009] 所述家蚕为家蚕的幼虫。
[0010] 本发明还提供了一种检测家蚕核型多角体病毒感染的试剂盒，该试剂盒用于检测 家蚕中bm〇-miR-277-5p的表达水平。通过检测bm〇-miR-277-5p与对照的表达水平，进行比 较，判断家蚕是否被BmNPV所感染:如果待判定家蚕的bm〇-miR-277-5p的表达水平显著高于 对照的表达水平，则提示家蚕已被BmNPV感染，否则则提示未被BmNPV感染。本发明中，所述 的显著是指具有统计学意义上的显著性，P<〇.05。
[0011] 本发明中所述的对照为未感染BmNPV的正常家蚕。
[0012]所述的试剂盒包含检测家蚕bm〇-miR-277-5p的荧光定量PCR扩增的引物以及反转 录引物。
[0013] 所述荧光PCR扩增的引物包括如SEQ ID N0.4所示碱基序列的正向引物和如SEQ ID NO.5所示碱基序列的反向引物。
[0014] 在荧光PCR扩增中，引物是核心与关键，本发明针对序列特别设计了扩增引物，除 了扩增引物，荧光PCR扩增反应体系中还包括酶、缓冲液、dNTP和染料，这些可采用市面成熟 的商用产品，也可自行配置。
[0015] 内参可采用U6SnRNA，所述的内参引物包括如SEQIDN0.6所示碱基序列的正向引 物和如SEQ ID N0.7所示碱基序列的反向引物。
[0016] 所述的荧光定量PCR试剂盒，还包括反转录试剂。所述的反转录试剂包括如SEQ ID NO. 3所示碱基序列的茎环引物。
[0017]通常，反转录试剂包括反转录酶、茎环引物、缓冲液、dNTP，其中，反转录酶、缓冲 液、dNTP为市面成熟的商用产品，也可自行配置。
[0018]本发明还提供了 bm〇-miR-277-5p在抑制基因表达中的应用，所述的基因转录后的 mRNA具有如SEQ ID从).12所示序列的3'17^。
[0019 ] m i cr oRNA能够与mRNA的3 '非翻译区结合，降解mRNA，从而抑制基因表达。
[0020]所述的基因为家蚕DNA胞嘧啶甲基转移酶。通过生物信息学软件预测，Dnmt2基因 (NM_001043469.1)是bm〇-miR-277-5p的潜在靶基因，3'UTR的荧光素酶报告基因实验结果 表明，bm〇-miR-277-5p可以通过与Dnmt2基因的3'UTR结合来抑制Dnmt2基因的表达。
[0021 ]与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
[0022]本发明通过茎环荧光定量PCR技术检测得到一种与家蚕核型多角体病毒感染相关 的microRNA，该microRNA为家蚕基因组编码的miR-277-5p，可为研究家蚕与核型多角体病 毒的互作机制提供新的研究方向，同时为家蚕核型多角体病毒的防治提供新的思路。
[0023] 本发明还首次证实了Dnmt2基因为bm〇-miR-277_5p的革巴基因，可用bm〇-miR-277- 5p抑制相关基因的表达水平。
[0024]本发明还提供了 bm〇-miR-277-5p在制备检测家蚕核型多角体病毒感染的试剂盒 中的应用，并提供了试剂盒，既方便使用，又可保证结果的一致性，具有重要的实际应用价 值，为家蚕核型多角体病毒感染检测提供新的检测手段，且分子检测具有快捷、灵敏、准确 的优势。
【附图说明】
[0025]图1为茎环荧光定量PCR技术检测家蚕bm〇-miR-277-5p的相对表达量的结果图；
[0026] 图2为bm〇-miR-277-5p与Dnmt2基因3'UTR的靶点结合示意图；
[0027] 图 3 为pmirGL〇-Dnmt2_3 ' UTR 及pmirGL〇-Dnmt2_3 ' UTR-mut 载体构建不意图；
[0028] 图4为双荧光素酶报告基因系统验证bm〇-miR-277-5p靶作用于Dnmt2基因的结果 图，其中，数值表示为Mean 土 STDVE，#为P < 0.01。
【具体实施方式】
[0029] 下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商所 建议的条件;所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0030] 实施例1应用茎环荧光定量PCR试剂盒检测bm〇-miR-277-5p在BmNPV感染家蚕中和 正常家蚕中的表达水平。
[0031] 1茎环荧光定量PCR试剂盒的组成
[0032] 本发明茎环荧光定量PCR试剂盒由反转录系统、扩增系统以及内参引物组成，具体 如下：
[0033] (1)反转录系统由gDNA Eraser、5XgDNA Eraser Buffer'PrimeScript RT Enzyme Mix I、5XPrimeScript Buffer(除莖环引物外，其他反转录试剂购自TaKaRa公 司）、茎环引物(序列如SEQIDN0.3所示）、RNase-freeddH20组成 ；
[0034] (2)扩增系统由2XSYBR Premix Ex Taq(购自TaKaRa公司）、bm〇-miR-277_5p正向 引物（序列如SEQIDN0.4所示）、bmo-miR-277-5p反向引物（序列如SEQIDN0.5所示）、 ddH20组成；
[0035] (3)内参为U6snRNA(snU6)，其正向引物的序列如SEQ ID N0.6所示，反向引物的序 列如SEQ ID N0.7所示。
[0036] 试剂盒中的引物序列如下：
[0037] 茎环引物（SEQ ID N0.3):
[0038] 5 '-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCAAACGC-3 '；
[0039] bm〇-miR-277-5p正向引物（SEQ ID N0.4):
[0040] 5，-ACACTCCAGCTGGGTCGTGCCAGGAGT-3，；
[0041] bm〇-miR-277-5p反向引物（SEQ ID N0.5):5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'。
[0042] 内参正向引物（SEQ ID N0.6):5'-CGTATACTAAAATTGGAACGATACAG-3'；
[0043] 内参反向引物（SEQ ID N0.7):5'-ATTTTGCGTGTCATCCTTGC-3'。
[0044] 2茎环荧光定量PCR试剂盒的应用
[0045] 步骤一，采用Trizol法提取待检样本(样本为家蚕的幼虫)的RNA。具体流程如下：
[0046] (1)将BmNPV感染家蚕和正常家蚕分别放入加有液氮的研钵中，用研杵迅速将样品 砸碎并磨成粉末，分装到无 RNA酶(RNase-free)的1.5mL Eppendorf管中，每0. lg组织加 lmL Trizol，样品体积应小于Trizol体积的10% ;
[0047] (2)振荡混匀，室温温育约1 Omin，12000g，4°C离心1 Omin;
[0048] (3)将上清转移到另一个新的离心管中，每mL加入0.2mL氯仿，即加入上清1/5体积 的氯仿，剧烈摇动15s，室温放置5min，12000g，4°C离心15min;混合物分成下层的红色苯酸-氯仿相，中间的蛋白质沉淀和上层无色水相。RNA即位于上清液；
[0049] (4)将上清液转移到另一个干净离心管中，等体积加入预冷的异丙醇，颠倒混匀， 室温静置l〇min，12000g，4°C离心10min，留下RNA沉淀，弃上清；
[0050] (5)加入 75% 乙醇，lmL Trizol 加 lmL 75% 乙醇，涡旋混匀，7500g，4°C 离心