基于霍乱毒素ct结构递药载体蛋白及体外构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于霍乱毒素 CT结构递药载体蛋白及其 体外构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 构建一种载体来协助诸如大蛋白质类药物高效、低毒、无创伤地穿过血脑屏障来 治疗中枢神经系统病症是目前研究的热点。人体免疫缺陷病毒HIV反式激活因子TAT，是一 种富含大量阳离子的短肽，目前研究表明，TAT与目标蛋白基因融合后形成的融合蛋白，能 够高效、快速、低剂量、无创伤地进入细胞，目前研究表明，但TAT的融合蛋白能在100ug/ml 的剂量下能于1小时内进入细胞，并且在细胞内的蛋白分布率达70 %以上。因此，TAT融合蛋 白显著改善目标蛋白跨膜能力已经毋庸置疑。天然的霍乱毒素(CT)分子由两个部分组成(A 和B)，B作为载体的作用，天然的结构为五聚体，其五聚体能与鼻腔内的神经节苷脂GMl结合 而并不进入细胞。A亚单位利用B亚单位五聚体中间的小孔，进入细胞，并于细胞体内水解成 Al和A2部分，Al和细胞内辅酶作用，干扰细胞信号，使细胞内大量盐离子外输，进而导致机 体缺水，引起腹泄甚至死亡。研究表明，与B亚基作用形成天然霍乱毒素的为A2部分，A2与B 之间通过亲疏水性的作用，紧密排列在一起，进而引导Al部分进入细胞，并致病。结合CT的 分子结构，用EGFP替换Al部分，并加以TAT修饰，使EGFP通过B亚单位进入细胞后，能够继续 穿膜，直接穿过血脑屏障，最终，构建获得一种嵌合蛋白CTB5/EGFP-CTA2-TAT.为了解决这 一难题。
[0003] 目前有专利报道通过将CTB和EGFP-CTA2-TAT共转化到同一宿主菌里，通过双抗性 筛选嵌合蛋白CTB5/EGFP-CTA2-TAT。然而，事实是CTB具有五对二硫键，非常容易形成包涵 体，上清中无法通过WESTERN BLOT和ELISA的方法检测出CTB的五聚体单位。并且在操作过 程中发现，CTB的包涵体的过表达，还会影响EGFP-CTA2-TAT蛋白上清的表达量，双质粒共转 化会造成宿舍菌内部负荷过重，导致细菌难长、不表达外源蛋白甚至直接死亡。形成嵌合蛋 白CTB5/EGFP-CTA2-TAT，并使其保持荧光，穿膜活性，更是难上加难。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是在于提供一种获得一种新型的嵌合蛋白，并高度保持其生物活 性。该嵌合蛋白能与鼻腔处的神经结苷脂受体结合，通过滴鼻给药的方式，将蛋白EGFP-CTA2-TAT以无创的方式经由鼻腔处进入体内。在生物体内，TAT与CTA2的KDEL序列协同作 作，大大提高EGFP穿膜的能力，使EGFP能够顺利穿过血脑屏障，并定位于脑部，以达到高效 治疗脑部等神经中枢性疾病。当载体上的EGFP(约26kd)替换为大小与之相类似的药物蛋 白，即发挥了本载体递药的作用，该载体未来很有可能成为脑部疾病患者的良药。
[0005] 本发明通过以下技术方案来实现：
[0006] 基于霍乱毒素 CT结构递药载体蛋白，为CTB5/EGFP-CTA2-TAT，为CTB5以及EGFP-CTA2-TAT嵌合组装而成。
[0007] 其中，CTB5的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1所示。
[0008] EGFP-CTA2-TAT的氨基酸序列为SEQIDN0:2所示。
[0009]基于霍乱毒素 CT结构递药载体蛋白的体外构建的方法，其步骤如下：
[0010] S1、基因克隆与表达
[0011] 采用BamHI/Hindin双酶切的方法，将编码CTB的基因克隆到双基因表达载体 petduet-Ι的多克隆位点1的位置，构建的载体命名为petduet-CTB;
[0012] 将编码有EGFP-CTA-TAT的基因克隆到表达载体pet22b( + )中，并去除其信号肽，克 隆时选用的酶切位点为NdeI和Xhol，构建的载体命名为pet22b-EGFP-CTA2-TAT;
[0013] S2、EGFP-CTA2-TAT可溶性蛋白表达与纯化
[0014] 质粒pet22b-EGFP-CTA2-TAT导入宿主菌，即大肠杆菌BL21 (DE3)中，并实现表达； pet22b-EGFP-CTA2-TAT在大肠杆菌BL21(DE3)系统中以可溶性形式表达，最终经由Ni-NTA 纯化得到电泳纯的产品；
[0015] S3、霍乱毒素 B亚单位包涵体蛋白纯化及复性
[0016] 质粒petduet-CTB导入宿主菌BL21 (DE3)中，并实现表达，表达产物为包涵体，包涵 体通过洗涤，去除表面杂质后，重新溶于梯度浓度的尿素中，通过电泳筛选纯的CTB单体， CTB单体经梯度透析复性形成稳定的CTB5;
[0017] S4、体外组装AB5结构嵌合蛋白
[0018] 纯化的CTB5与EGFP-CTA2-TAT通过超滤除去大部分的盐离子后，按CTB5:EGFP- CTA2-TAT的质量比为5:1至8: !的比例投入反应容器中，通过加入柠檬酸使混合物的pH值为 2.3-3.0之间，20s后迅速加入EDTA二钠调节PH至8.5.室温静置至少1小时，直至荧光逐渐恢 复，即可。
[0019] 进一步地，设计引物如下：CGCGGATCCAACACCTCAAAATATTACTGATTT和 CAGCCAACTCAGCTTCCTT，用于从pet28a-CTB中扩增目标基因序列CTB即编码CTB的基因。
[0020] 进一步地，设计引物如下：CGGAATTCCATATGG TGAGCAAGG 和 CCGCTCGAGCTGTGGTGGAC，用于从合成的基因序列中扩增具有酶切位点Ndel/Xhol的基因序 列EGFP-CTA2-TAT，即编码有 EGFP-CTA-TAT 的基因。
[0021 ]进一步地，为方便纯化，保留载体petduet-CTB上原有的组氨酸标签。
[0022] 进一步地，为方便纯化，保留载体pet22b-EGFP-CTA2_TAT上原有的组氨酸标签。
[0023]进一步地，EGFP-CTA2-TAT的基因序列之间用连接肽作了相应的修饰。
[0024] 嵌合蛋白CTB5/EGFP-CTA2-TAT用于肿瘤的治疗。
[0025] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：
[0026] 1.体外组装干扰少，实验表明，得到的蛋白纯净度高，并且更稳定。
[0027] 2.体外组装区别于共转化到同一宿主菌的是，重复性强，并且细菌表达无负担，可 快速获得蛋白原料。
[0028] 3.本发明首次验证了嵌合蛋白CTB5/EGFP-CTA2-TAT与GMl的结合活性，并且结果 表明其保持与GMl结合的高度活性。
[0029] 4.本发明首次用HPLC的方法来验证CTB5/EGFP-CTA2-TAT是否形成，结果表明， CTB5/EGFP-CTA2-TAT能够经由酸碱度调节形成。
[0030] 5.本发明区别于共转化的是，单独获得了蛋白EGFP-CTA2-TAT与CTB5.并且，CTB5 有肿瘤杀伤力，EGFP-CTA2-TAT有相比于EGFP-TAT更高效的穿膜能力，在剂量为5ug下，可于 15min内进入细胞，并且对细胞无杀伤力，相较于文献报导的EGFP-TAT，100ug，l小时，有显 著的剂量降低作用。
【附图说明】
[0031] 图 1 是质粒 petduet-CTB 图谱；
[0032] 图 2 是质粒 pet22b-EGFP-CTA2-TAT图谱；
[0033] 图3是蛋白电泳图：
[0034]左起Marker(116kda，66· 2kda，45kda，35kda，25kda，18·4kda，14·4kda.); I ,CTB单 体纯化结果;2，EGFP-CTA2-TAT蛋白纯化结果;3，CTB复性后蛋白电泳结果；
[0035]图4为用抗GFP-抗作用EGFP-CTA2-TAT蛋白结果及用抗CTB-抗作用CTB蛋白电泳 图；
[0036]图5是native page及蓝光灯激发下AB5蛋白组装结果示意图：
[0037] A左起为marker(116kda，66·2kda，45kda，35kda，25kda，18·4kda，14·4kda); 1，组 装的复合物蛋白电流结果2，CTB5组装后结果3，EGFP-CTA2-TAT非变性电泳结果；
[0038] 图6图蓝光灯激发下AB5蛋白组装结果示意图；
[0039] 图 7是纯化的 EGFP-CTA2-TAT的 HPLC图谱；
[0040] 图8是纯化的CTB5的HPLC图谱；
[0041 ]图9是组装后的混合物AB5的HPLC图谱；
[0042]图10是GMl-elisa测定蛋白与GMl的结合能力的示意图；
[0043]图11是荧光显微镜视野下的PC3细胞图像：
[0044] A列为自然光下观察的PC3细胞的结果，B列为荧光激发下观察PC3细胞的结果。
【具体实施方式】
[0045]以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限 定。
[0046]实施例中的部分原料试剂如下：
[0047] petDute-l、pet28a-CTB为本实验室构建;基因序列EGFP-CTA2-TAT由北京普尔普 乐公司合成;E.coli DH5a细胞、E. Co I i BL21 (DE3)细胞均由本实验室保存，使用前进行菌种 测序鉴定；限制性内切酶BamHI、HindΙΠ、Nde I、Xho I均购自Thermo公司；质粒提取试剂盒、 PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒、氨苄青霉素、卡那霉素购自上海生物工程公司；琼脂 糖、胰蛋白胨、氯化钠、酵母粉购自瑞尔欣德公司；IPTG购自Sigma公司；丙炼酰胺、甲叉丙烯 酷胺、过硫酸铵、1^ 8、617(^116、505、考马斯亮蓝1?-250、1'?的11-20，异丙醇、冰醋酸、乙醇、甲 醇、甘油等均为国产分析纯;pfu mix购自Novage公司；DL5000marker购自Novage公司。抗体 购自SAB公司，CTB标准品购自sigma公司。电泳等其它试剂及耗材为国产分析纯。
[0048] LB培养基的配置：
[0049] 胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠 IOg加入800ml的ddH20于烧杯中，充分溶解 后，用lmol/L NaOH调PH至7.0-7.2之间，最后定容于IL的容量瓶中。取5ml分装于试管中， 121度，20min高压蒸汽灭菌，备用。
[0050] 实施例1
[0051 ] 基因克隆与表达：
[0052] 参照图 1和图2,设计引物如下：CGCGGATCCAACACCTCAAAATATTACTGATTT和 CAGCCAACTCAGCTTCCTT，用于从pet28a-CTB中扩增目标基因序列CTB，设计引物如下， CGGAATTCCATATGG TGAGCAAGG和CCGCTCGAGCTGTGGTGGAC，用于从合成的基因序列中扩增具 有酶切位点Ndel/Xhol的基因序列EGFP-CTA2-TAT.扩增后的CTB通过BamHI/Hindlll双酶切 克隆入载体petduet-Ι的多克隆位点1的位置，而EGFP-CTA2-TAT通过Ndel/Xhol双酶切克隆 入载体pet2