力测定见附图4,可见在完全血清培养基条件下，随着细 胞培养时间和多肽处理的增加，HUVEC的存活率逐渐降低，细胞杀伤率也逐步增加，显示9R-P201对HUVEC也具有一定的杀伤作用，在80yg/mL时，存活率下降到约30% (即细胞抑制率约 70 % )，但显著低于对Η印G2的抑制率。IC50值为66.8μg/ml。
[0102] 2、完全培养基CCK-8检测9R-P201对人肝细胞L-02的影响
[0103] (1)实验方法同实施例二之1。
[0104] (2)实验结果
[0105] 细胞形态学变化及细胞活力测定见附图5,可见在完全血清培养基条件下，经24hr 培养，即使9R-201浓度在80、100yg/mL时，L-02仍有60 % -70 %的存活率，显著高于HUVEC内 皮细胞在相应时间的存活率，远高于癌细胞、尤其是肝癌细胞的存活率。显示该多肽尤其对 肝癌细胞的选择性杀伤作用。其IC50值高达2856μg/ml。
[0106] 实施例四、多肽8R-P201对癌细胞株的杀伤作用
[0107] 1、完全培养基MTT检测8R-P201对人肝癌细胞HepG2的杀伤作用
[0108] (1)实验方法。
[0109]细胞培养:同实施例二之1。
[0110] 细胞处理:类同实施例三之2,多肽处理时间48hr。
[0111] MTT细胞活力测定：不同浓度的PAMs处理到达时间点后，吸去细胞培养液，每孔加 入加入l〇〇yL的无酚红DMEM培养基和20yL MTT(5mg/mL)溶液，37°C继续培养4h后，吸去上 清，每孔加入150yL DMS0溶解紫色沉淀，振摇lOmin后，酶标仪测定其Α57〇γ?的吸光度值。
[0112] (2)实验结果
[0113] 细胞形态学变化及细胞活力测定见附图6，可见在完全血清培养基条件下，与9R-P201作用相似，随着培养时间的延长和处理浓度的提高，细胞死亡率逐步增加，经48hr处 理，有大量细胞死亡，48hr处理60μg/ml浓度下细胞杀伤率达到96%，计算得IC50为25.5yg/ ml〇
[0114] 2、完全培养基MTT检测8R-P201对人乳腺癌细胞MCF7的杀伤作用
[0115] (1)实验方法同实施例四之1。
[0116] (2)实验结果
[0117]细胞形态学变化及细胞活力测定见附图7，可见在完全血清培养基条件下，随着培 养时间的延长和处理浓度的提高，细胞死亡率逐步增加，经48hr处理，有大量细胞死亡， 48hr处理60μg/ml浓度下细胞杀伤率在80%，计算得IC50为33.7μg/ml。
[0118] 3、A0/EB双染检测8R-P201对人肝癌HepG2细胞的促凋亡和杀伤作用
[0119] (1)实验方法
[0120]用镊子将灭菌好的盖玻片放入六孔板中，每孔一片。将HepG2对数生长期细胞按 2.5 X 105个/ml的浓度接种到六孔板中，放入培养箱过夜培养。第二天加入40μg/ml的8R-P201处理24hr后，取出实验组和对照组对的盖玻片，用预冷的roS洗涤细胞两次，放置于载 玻片上。
[0121] 将A0和EB工作液等体积混合，加入lyL Α0-ΕΒ混合液到25yL的ros中，轻轻混匀后 将液体铺满整个盖玻片，在荧光显微镜下观察和拍照。
[0122] (2)实验结果
[0123] 细胞形态可见HepG2细胞在40μg/ml的8R-P201处理24hr下呈现与对照相比显著增 加的凋亡细胞和染色质浓缩，揭示多肽处理对！fepG2细胞促凋亡和细胞杀伤作用。
[0124] 实施例五、完全培养基MTT检测8R-P201对正常人胚肾293T细胞杀伤作用
[0125] (1)实验方法同实施例四之1。
[0126] (2)实验结果
[0127] 细胞形态变化，可见48hr多肽处理对293T细胞具有一定的杀伤作用，但从形态学 变化可以清楚看出，其对293T细胞的杀伤作用明显低于Η印G2和MCF7细胞。
[0128] 实施例六、9R-P201处理对HepG2、HUVEC细胞迀移与侵袭的抑制作用
[0129] 1、细胞划痕(Wound healing)检测9R-P201处理对人肝癌HepG2细胞迀移的抑制作 用
[0130] (1)实验方法
[0131] 首先，细胞铺6孔板，2.5 X 105cells/wel 1，当细胞至85 %左右时，用200yL枪头划 痕；
[0132] 其次，PBS洗去划下的细胞，实验组加药(60yg/mL)，对照组则换液处理；
[0133 ]最后，拍照并用Image J定量比较细胞迀移的速度。
[0134] (2)实验结果
[0135] 结果见附图8,可见9R-P201处理后，细胞迀移很小，统计分析结果显示，细胞相对 迀移率极显著差异(#*p〈0.001)，表明9R-P201对Η印G2的迀移具有强的抑制作用。
[0136] 2、细胞划痕检测9R-P201处理对人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞迀移的抑制作用
[0137] (1)实验方法同实施例六之1。
[0138] (2)实验结果
[0139] 从附图9可以明显的看出，9R-P201对HUVEC的迀移有较强的抑制作用，数理统计分 析也显示出细胞相对迀移率极显著的差异(#*Ρ〈0.001)。鉴于HUVEC在血管的形成中起到 重要的作用，Ρ201对HUVEC迀移的抑制可能对肿瘤细胞微血管的形成产生抑制作用。
[0140] 3、Transwell细胞侵袭实验检测9R-P201处理对人HepG2细胞迀移的抑制作用
[0141] (1)实验方法
[0142] 细胞铺板，当汇合度达到80 %时，60yg/mL的9R-P201处理24hr，收集细胞并计数， 按lX104cells/well加入小室的上室，下室加入600μ1完全DMEM培养基（10%FBS)，培养24h 后观察。
[0143] 小室取出，棉签擦去上室细胞，PBS洗涤，4 %多聚甲醛固定30min，0.1 %结晶紫染 色20min，拍照。
[0144] (2)实验结果
[0145] 从附图10可清晰看出，经9R-P201处理后的HepG2细胞较对照组呈现明显减少的迀 移细胞数量，统计分析显示呈现极显著差异(***P〈〇.003)。
[0146] 综上所述，以上实施例与结果表明该多肽分子具有对人体肝癌、前列腺癌、乳腺癌 等恶性肿瘤细胞强的杀伤作用，而对正常人肝细胞、胚肾细胞、脐静脉内皮细胞则显示较低 的杀伤作用，尤其是与对照肝细胞相比，对肝癌细胞具有强的选择性杀伤作用，同时具有对 人肝癌、脐静脉内皮细胞迀移的抑制作用。该多肽分子可望作为先导药物用于研发分子靶 向肝癌等恶性肿瘤细胞的选择性杀伤和迀移抑制方面的创新药物。
【主权项】
1. 一种具有癌细胞选择性杀伤和抑制作用的多肽分子，通过在多肽SEQ ID No: 1的N-端添加9个D-型精氨酸以及二聚甘氨酸丝氨酸，形成序列为RRRRRRRRRGSGSWHLDYPSMWYLD的 25个氨基酸的多肽序列。2. -种具有癌细胞选择性杀伤和抑制作用的多肽分子，通过在多肽SEQ ID No: 1的N-端添加8个D-型精氨酸以及二聚甘氨酸丝氨酸，形成序列为RRRRRRRRGSGSWHLDYPSMWYLD的 24个氨基酸的多肽序列。3. -种具有癌细胞选择性杀伤和抑制作用的多肽分子的设计方法，在多肽序列与组成 SEQ ID No: 1的基础上，多肽序列限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或多个 氨基酸改造的多肽分子。4. 根据权利要求3所述的一种具有癌细胞选择性杀伤和抑制作用的多肽分子设计方 法，其特征在于:所述改造的多肽分子是在多肽SEQ ID N〇:l的基础上，通过其N-端添加9个 或8个D-型精氨酸以及二聚甘氨酸丝氨酸，形成N-端含有多聚-D型精氨酸的多肽序列。5. -种具有癌细胞选择性杀伤和迀移抑制作用的多肽分子的用途，其特征在于:权利 要求1、或权利要求2所述的多肽分子可以作为靶向先导药物用于制备具有杀伤肝癌、前列 腺癌或乳腺癌细胞的药物。6. -种具有癌细胞选择性杀伤和迀移抑制作用的多肽分子的用途，其特征在于:权利 要求1所述的多肽分子可以作为靶向先导药物用于制备具有抑制肝癌细胞、人脐静脉内皮 细胞迀移的药物。
【专利摘要】本发明公开了一种具有癌细胞选择性杀伤作用的多肽分子及其设计方法与用途。属于生物制药应用技术领域。包括多肽氨基酸序列与组成(SEQ？ID：No.1)，共含12个氨基酸。经9R或8R偶联改造和设计，该多肽分子具有对人肝癌、前列腺癌、乳腺癌等恶性肿瘤细胞强的杀伤作用，而对正常人肝细胞、胚肾细胞、脐静脉内皮细胞则显示较低的杀伤作用，尤其是与对照正常人肝细胞相比，对肝癌细胞具有强的选择性杀伤作用，同时具有对人肝癌、脐静脉内皮细胞迁移的抑制作用。主要用于制备肝癌等恶性肿瘤细胞的选择性杀伤和迁移抑制方面的药物。
【IPC分类】C07K14/47, A61P35/00, A61K38/17
【公开号】CN105524159
【申请号】CN201510783946
【发明人】茆灿泉, 崔健, 邬怡然, 毕振飞, 黄家明, 郭泰林
【申请人】西南交通大学
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2015年11月16日