赖氨酸和对应的tRNA发生转运反应，从而 把吡咯赖氨酸连接到对应tRNA上，延伸因子EF-Tu携带上述产物至核糖体，参与蛋白质合 成。tRNA又称转运RNA(transfer ribonucleic acid tRNA)，是具有携带并转运氨基酸功能 的一类小分子核糖核酸。但是野生型的产甲烷厌氧菌的PylRS(吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成 酶)并不识别香豆素赖氨酸，因此并不能确定哪一种PylRS突变体能够识别香豆素赖氨酸， 所以要做突变-建库-筛选(定向进化），最终筛选到能够特异识别香豆素赖氨酸的PylRS突 变体，即命名为CoukRS。
[0044] 在本实施例中，如图2所示，图2为本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法 的步骤Sl的流程示意图。步骤Sl为获得M.Barkeri PylRS突变库;在实现步骤Sl的过程中， 又可分8个步骤来实现，分别是步骤311、312、313、314、315、316、317和318。在步骤311中首 先人工合成M.Barkeri PyIRS的DNA序列，然后通过步骤Sl2将M.Barkeri PylRS的DNA连接 到pBK质粒上，既可以通过传统酶切链接，也可以采用分步PCR方法，利用饱和突变的方法， 设计引物，把单个氨基酸的密码子突变为NNK (N代表A，T，C，G四种密码子，K代表T，G两种密 码子)NNK组合把一个氨基酸的密码子突变为4*4*2 = 32种，对应20种氨基酸。达到"无中生 有"的目的，最终获得重组质粒A。此外，pBK质粒比较小，有利于下游的大容量库的构建。当 上述合成的M.Barkeri PylRS的编码DNA连接到pBK质粒中，是通过分步聚合酶链式反应 (PCR)方法时，实现步骤如下:在特定50微升PCR扩增体系和特定方法下实现突变库的构建。 50微升PCR扩增体系包括:无菌水40微升、10倍浓度的缓冲液5微升，质粒DNA模板1微升，PCR 扩增引物正负链各1微升，IOmM dNTPs 1微升，高保真酶1微升。以下各步骤PCR反应体系均 按照该体系进行。以上所述的反应体系，在PCR扩增仪上进行扩增，PCR反应扩增的方法为： 94°C，4分钟，预变性;94°C，1分钟，变性;58°C，30秒，退火;72°C，3分钟，延伸；重复变性-退 火-延伸步骤26个循环后，72°C保温5分钟，然后降温到16度，完成反应。以下各步骤突变库， 均按照此方法进行。每一步骤的PCR扩增后，需要经过电击感受态大肠杆菌进行转化，并在 大肠杆菌中进行扩增，经过质粒提取步骤得到可用于下一步PCR扩增反应的质粒。以上所述 的可用于电击的感受态的制备采用标准步骤进行。
[0045] 在本实施例中，设计定点突变引物的原理为先把野生型的pylrs连接到pbk上，然 后设计引物(在特定位点有突变），PCR后，得到本底pylrs-pbk和突变pylrs-pbk，由于本底 的pylrs-pbk从DH5a中提取，腺噪呤核苷上会甲基化，用特异识别甲基化腺噪呤核苷的DpnI 酶切即可去除本底。得到的线性质粒片段(含有突变)转化到感受态细胞中，得到环化的质 粒。提取环化的质粒，以此为模版，再利用另一对突变引物进行突变，同样用DpnI处理，得到 突变库2,再次重复，得到突变库3,得到突变库4。把单个氨基酸的密码子突变为NNK(N代表 A，T，C，G四种密码子，K代表T，G两种密码子。）NNK组合把一个氨基酸的密码子突变为4*4*2 =32种，对应20种氨基酸。根据蛋白质晶体结构，可以获得结合底物的酶活中心，该中心由 多个氨基酸组成，经过Insight II分子模拟计算，分子模拟软件Insight II对PylRS酶活力 中心进行测算，可以预测底物分子周围的氨基酸，这些氨基酸是进化PylRS的重要依据。在 步骤S13中，通过定点突变原理设计4对不同的引物，如表1所示，表1为采用本发明较佳实施 例的引物的序列。该4对引物分别是引物f_Y349D、引物r-Y349D、引物f-L270I、引物r-L2701、引物f-N311F313NNK、引物r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK。在步骤 S14中，利用步骤S13中的引物f-Y349D、引物r-Y349D，通过PCR(聚合酶链式反应），可获得突 变库1;同理，利用步骤S13中的引物f-L270I和引物r-L270I、引物f-N311F313NNK和引物『_ N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK，分别通过PCR(聚合酶链式反应），可分别获 得突变库2、突变库3、突变库4。将得到的突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照预定的 比例混合，该比例可以设置成1:1:32:32,最终可获得用于7-羟基香豆素筛选用的 M.Barkeri PylRS突变库。详细步骤如下：在以上所述反应体系中加入上述引物f-Y349D和 引物r-Y349D，进行PCR扩增，得PCR产物I; PCR产物1，经过电击转化到感受态大肠杆菌中扩 增，经质粒提取，得到突变库1;以上述突变库1为模板，在反应体系中加入上述引物f-L2701 和引物r-L270I，经PCR扩增和上述突变库1相同的步骤处理，得到突变库2;以上述突变库2 为模板，经过引物f_N311F313NNK和引物r-N311F313NNK扩增，得到PCR产物3，PCR产物3经过 上述突变库1相同的制备方法，得到突变库3，突变库3经过引物Y349NNK-f和引物Y349NNK-r 引物扩增、转化、质粒提取步骤得到突变库4;把以上所述突变库1-4按照1:1: 32:32的比例 混合，得到最终用于7-羟基香豆素筛选用的M.Barkeri PylRS突变库(Lib-CouK)。
[0046] 表1为采用本发明较佳实施例的引物的序列
[0048] 如图3所示，图3为本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法的步骤S2的流程 示意图。在步骤S2中，主要涉及香豆素赖氨酸的合成，如图4所示，图4为本发明香豆素赖氨 酸的结构示意图。其合成步骤如下:在步骤S21中，首先取间苯二酚5.5克，溶于水中，并加热 到90°C，慢慢向间苯二酚溶液中滴加溶于水的苹果酸6.7克，反应2小时，得到7-羟基香豆 素;在步骤S22中，取7-羟基香豆素1克，赖氨酸0.224克，分别溶于水，60°C搅拌12个小时过 夜。经液相色谱分离，得到香豆素赖氨酸。把上述体系放大10倍后，得到3克7-羟基香豆素赖 氨酸以供筛选。在本实施例中，香豆素赖氨酸B经过0.22微米滤膜过滤除菌。
[0049] 如图5所示，图5为本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法的步骤S3的流程 示意图。在步骤S3中，主要筛选特异识别7-羟基香豆素的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶 (CouKRS)突变体:在步骤S2中合成的非天然氨基酸7-羟基香豆素，溶解到水中，经过0.22微 米滤膜过滤除菌，得到终浓度为IOOmM的7-羟基香豆素母液。进行筛选之前，构建正筛选 pylT-pREP质粒，和用于表达验证的pylT-pBAD质粒。所述CouKRS的筛选步骤如下：首先共转 化Lib-CouK和pylT-pREP质粒于ToplO大肠杆菌感受态中，ToplO大肠杆菌感受态细胞可用 于DNA的化学转化。经37°C，1小时孵育后，涂布在正筛选培养板上。正筛选把目的克隆呈现 出来，对应的负筛选则是把非目的克隆剔除。正筛选培养板的配制方法如下：100毫升LB培 养基中加入〇.〇15g琼脂粉，高压灭菌处理，并降温到60°C;在其中加入1毫升以上所述的浓 度为IOOmM的7-羟基香豆素母液，100微升80毫克/毫升的氯霉素液体，浓度为50mM的四环素 100微升，浓度为50mM的卡那霉素100微升，混勾过后，倒入无菌培养板中，冷却后备用。经过 37°C下，48小时的培养，挑选在正筛选板子上存活的单克隆细菌进行培养12小时，得到的单 克隆细菌分别印在两种培养基上1和培养基2上。培养基1的配方为：100毫升LB培养基中加 入〇.〇15g琼脂粉，高压灭菌处理，并降温到60°C;在其中加入1毫升以上所述的浓度为IOOmM 的7-羟基香豆素母液，150微升80毫克/毫升的氯霉素液体，浓度为50mM的四环素100微升， 浓度为50mM的卡那霉素100微升，混匀过后，倒入无菌培养板中，冷却后备用。培养基2的配 方为：100毫升LB培养基中加入0.015g琼脂粉，高压灭菌处理，并降温到60°C;在其中加入50 微升80毫克/毫升的氯霉素液体，浓度为50m