[0056] (2)、CM-32用注射用水溶胀后用0. 5M氢氧化钠反应30 min后，冲洗至中性；再 用0. 5M盐酸反应30min后，冲洗至中性，装柱，用pH8. 0的0. 01M磷酸缓冲液平衡。
[0057] (3)、取10g眼镜蛇粗毒加 4倍量pH8. 0的0. 01M磷酸缓冲液溶解，3000rpm离心 lOmin，待用。
[0058] (4)、经步骤（3)离心后的蛇毒溶液上平衡后的S印hadex G-50柱，PH8.0的0.01M 磷酸缓冲液洗脱，流速40ml/h，自动部分收集器收集滤液。
[0059] (5)、24小时后，紫外分光光度计检测收集，收集E峰。
[0060] (6)、收集的E峰上平衡后的CM-32柱，0. 01M磷酸缓冲液洗脱16h后，换含0. 10M 氯化钠的磷酸缓冲液洗脱，流速60ml/h，24小时后开始检测收集液，收集目的峰。收集的目 的峰，冷冻干燥，得科博肽0. 912g，纯度为99. 2%。
[0061] 实施例2 :眼镜蛇毒神经毒素的制备： (1 )、S印hadex G-50用注射用水膨胀，装柱后用ρΗ7· 9的0· 01M磷酸缓冲液平衡。
[0062] (2)、CM-32用注射用水溶胀后用0. 5Μ氢氧化钠反应30 min后，冲洗至中性；再 用0. 5M盐酸反应30min后，冲洗至中性，装柱，用pH7. 9的0. 01M磷酸缓冲液平衡。
[0063] (3)、取10g眼镜蛇粗毒加4倍量ρΗ7· 9的(λ 01M磷酸缓冲液溶解，3000rpm离心 lOmin，待用。
[0064] (4)、经步骤（3 )离心后的蛇毒溶液上平衡后的S印hadex G-50柱，ρΗ7·9的 0. 01Μ磷酸缓冲液洗脱，流速30ml/h，自动部分收集器收集滤液。
[0065] (5)、24小时后，紫外分光光度计检测收集，收集E峰。
[0066] (6)、收集的E峰上平衡后的CM-32柱，0. 01M磷酸缓冲液洗脱16h后，换含0. 10M 氯化钠的磷酸缓冲液洗脱，流速50ml/h，24小时后开始检测收集液，收集目的峰。收集的目 的峰，冷冻干燥，得科博肽0. 894g，纯度为97. 6%。
[0067] 实施例3 :眼镜蛇毒神经毒素的制备： (1 )、S印hadex G-50用注射用水膨胀，装柱后用pH8. 1的0. 01M磷酸缓冲液平衡。
[0068] (2)、CM-32用注射用水溶胀后用0. 5M氢氧化钠反应30 min后，冲洗至中性；再 用0. 5M盐酸反应30min后，冲洗至中性，装柱，用pH8. 1的0. 01M磷酸缓冲液平衡。
[0069] (3)、取10g眼镜蛇粗毒加4倍量pH 8. 1的(λ 01M磷酸缓冲液溶解，3000rpm离心 lOmin，待用。
[0070] (4)、经步骤（3 )离心后的蛇毒溶液上平衡后的S印hadex G-50柱，pH 8. 1的 0. 01M磷酸缓冲液洗脱，流速50ml/h，自动部分收集器收集滤液。
[0071] (5)、24小时后，紫外分光光度计检测收集，收集E峰。
[0072] (6)、收集的E峰上平衡后的CM-32柱，0. 01M磷酸缓冲液洗脱16h后，换含0. 10M 氯化钠的磷酸缓冲液洗脱，流速70ml/h，24小时后开始检测收集液，收集目的峰。收集的目 的峰，冷冻干燥，得科博肽0. 905g，纯度为97. 3%。
[0073] 实施例4 :眼镜蛇毒神经毒素的制备： (1 )、S印hadex G-50用注射用水膨胀，装柱后用ρΗ7· 9的0· 01M磷酸缓冲液平衡。
[0074] (2)、CM-32用注射用水溶胀后用0. 5Μ氢氧化钠反应30 min后，冲洗至中性；再 用0. 5M盐酸反应30min后，冲洗至中性，装柱，用pH7. 9的0. 01M磷酸缓冲液平衡。
[0075] (3)、取10g眼镜蛇粗毒加4倍量ρΗ7· 9的(λ 01M磷酸缓冲液溶解，3000rpm离心 lOmin，待用。
[0076] (4)、经步骤（3 )离心后的蛇毒溶液上平衡后的S印hadex G-50柱，pH 7. 9的 0. 01M磷酸缓冲液洗脱，流速50ml/h，自动部分收集器收集滤液。
[0077] (5)、24小时后，紫外分光光度计检测收集，收集E峰。
[0078] (6)、收集的E峰上平衡后的CM-32柱，0. 01M磷酸缓冲液洗脱16h后，换含0. 10M 氯化钠的磷酸缓冲液洗脱，流速70ml/h，24小时后开始检测收集液，收集目的峰。收集的目 的峰，冷冻干燥，得科博肽0. 910g，纯度为97. 8%。
[0079] 实施例5 :眼镜蛇毒神经毒素的制备： (1 )、S印hadex G-50用注射用水膨胀，装柱后用pH8. 1的0. 01M磷酸缓冲液平衡。
[0080] (2)、CM-32用注射用水溶胀后用0. 5M氢氧化钠反应30 min后，冲洗至中性；再 用0. 5M盐酸反应30min后，冲洗至中性，装柱，用pH8. 1的0. 01M磷酸缓冲液平衡。
[0081] (3)、取10g眼镜蛇粗毒加4倍量PH 8. 1的0. 01M磷酸缓冲液溶解，3000rpm离心 lOmin，待用。
[0082] (4)、经步骤（3 )离心后的蛇毒溶液上平衡后的S印hadex G-50柱，pH 8. 1的 0. 01M磷酸缓冲液洗脱，流速30ml/h，自动部分收集器收集滤液。
[0083] (5)、24小时后，紫外分光光度计检测收集，收集E峰。
[0084] (6)、收集的E峰上平衡后的CM-32柱，0. 01M磷酸缓冲液洗脱16h后，换含0. 10M 氯化钠的磷酸缓冲液洗脱，流速50ml/h，24小时后开始检测收集液，收集目的峰。收集的目 的峰，冷冻干燥，得科博肽0. 900g，纯度为98. 3%。
[0085] 实施例6 :科博肽注射液的制备(注射剂） 取70mg上述实施例1-5制得的科博肽原料，加入配制药液总量10%氯化钠注射液， 使其溶解，〇. 45 μ m过滤器滤过，检测含量，再加氯化钠注射液至全量2000ml，调节pH值至 5-7,灌封，60°C保温30min，间隔24h，保温三次。制备成小容量注射制剂1000支，每支规 格：2ml:70 μ g。
[0086] 实施例7 :注射用科博肽的制备(冻干粉针剂） 取70mg上述实施例1-5制得的科博肽原料，加入配制药液总量80%的注射用水溶解， 再加入甘露醇，搅拌均匀，加注射用水至全量2000ml，搅匀，调节pH值至5-8,无菌滤过，滤 液分装于灭菌西林瓶中，冷冻干燥，制备成冻干粉针制剂1000瓶，每瓶规格：70 μ g。
【主权项】
1. 一种便捷、快速的科博肽分离提取工艺，其特征在于：包括以下步骤： (1) 、S印hadex G-50用注射用水膨胀，装柱后用pH7. 9-8. 1的0· 01M磷酸缓冲液平衡； (2) 、CM-32用注射用水溶胀后用0. 5Μ氢氧化钠反应30min后，冲洗至中性；再用0. 5Μ 盐酸反应30min后，冲洗至中性，装柱，用pH7. 9-8. 1的0. 01M磷酸缓冲液平衡； (3) 、眼镜蛇粗毒加3-5倍量pH7. 9-8. 1的0. 01M磷酸缓冲液溶解，3000rpm离心10min， 待用； (4) 、经离心后的蛇毒溶液上平衡后的S印hadex G-50柱，pH7. 9-8. 1的0. 01M磷酸缓 冲液洗脱，流速30-50ml/h，自动部分收集器收集滤液； (5) 、24小时后，紫外分光光度计检测收集，收集E峰； (6) 、收集的E峰上平衡后的CM-32柱，用pH7. 9-8. 1的0. 01M磷酸缓冲液洗脱16h后， 换含0. 10M氯化钠的磷酸缓冲液洗脱，流速50-70ml/h，24小时后开始检测收集液，收集目 的峰，收集的目的峰，冷冻干燥，即得科博肽。2. 根据权利要求1所述的科博肽分离提取工艺，其特征在于：所述步骤（1)、（2)、（3)、 (4)、（6)的0· 01M磷酸缓冲液PH为8. 0。3. 根据权利要求1所述的科博肽分离提取工艺，其特征在于：所述步骤（4) Sephadex G-50柱洗脱流速为40ml/h。4. 根据权利要求1所述的科博肽分离提取工艺，其特征在于：所述步骤^)CM-32柱洗 脱流速为60ml/h。5. -种由权利要求1所述的分离提取工艺制得的科博肽，其特征在于：所述的科博肽 的纯度大于97%。6. -种包含权利要求1、5任一所述的科博肽加入药学上可接受的辅料，按常规制剂工 艺制成药物学意义上的各种制剂。7. 根据权利要求6所述的制剂，其特征在于：可制成注射制剂、口服制剂。8. 根据权利要求7所述的制剂，其特征在于：所述的注射制剂为小容量注射剂或冻干 粉针剂。
【专利摘要】本发明属于生物医药提取技术领域，具体涉及一种便捷、快速的科博肽分离提取工艺。该方法采用SephadexG-50柱将处理后的蛇毒原液按不同相对质荷比的分子由大至小一一分开，分离筛分出目标E峰,再用阳离子CM-32交换层析柱对目标E峰进行分离纯化，冷冻干燥，得到科博肽；该方法工艺简单，易于操作，质量较好控制，大大缩短了生产周期，降低了生产成本；最终产物纯度大于97%，更适合于工业大生产。
【IPC分类】C07K1/16, C07K14/46, A61K38/17
【公开号】CN105566482
【申请号】CN201410529341
【发明人】窦啟玲, 苏凯
【申请人】贵州益佰制药股份有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年10月10日