一种蓝细菌脂肪烃合成关键基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及能源微生物种质资源与基因资源领域，具体而言是一种藍细菌脂肪姪 合成关键基因。
【背景技术】
[0002] 能源是现代工业的支柱，W化石燃料为代表的传统能源的日益短缺是制约我国经 济可持续发展的瓶颈，可再生的生物燃料的应用成为缓解能源危机并改善生态环境的最佳 选择之一。在交通运输业中广泛使用的汽油、柴油和航空煤油等化石燃料的主要成分是特 定链长范围的脂肪姪，脂肪姪具有高能量密度、低吸湿性、低挥发性、与现有发动机相兼容 等优点，是传统石化液体燃料的最佳替代品化easling and化OU 2008)。
[0003] 石油、古代沉积物W及隅石中包含了大量可能为生物来源的物质，其中脂肪姪也 是最受关注的成员之一。科学家曾针对传统化石能源的起源提出了腐朽的藻类细胞是其组 成成分的理论（Han and Calvin 1969)。而自上世纪六十年代末期开始的关于藍细菌中脂 肪姪的研究主要是围绕分析和鉴定不同藍细菌（或者其他真核藻类）的脂肪姪组成和含 量展开的。目前已报道的野生藍细菌中脂肪姪含量最低占细胞干重的0.01% (Winters et al. 1969)，最高可达0.26% (Coates et al. 2014)。研究发现其链长主要集中于C15至C20 之间，且W C17为主化an et al. 1968)。
[0004] 作为新一代能源微生物系统，藍细菌具有W下优势；（1)与合成生物燃料的异养 微生物反应器大肠杆菌、酿酒酵母等不同，藍细菌能够利用太阳能并可W二氧化碳作为碳 源生长，具备种类丰富、培养成本低、生命力强、生长速率快等优点。（2)从基因工程角度考 虑，与同样可利用太阳能和二氧化碳的真核微藻、高等植物不同，藍细菌作为合成脂肪姪的 宿主，其基因操作更为简易，可进行大规模的遗传改造。（3)藍细菌具有相对清晰的遗传背 景。目前已公布了 130余株藍细菌的全基因组序列（Shih et al. 2013)。
[0005] 得益于分子生物学、生物信息学和代谢工程技术等的迅猛发展，目前已经在藍细 菌中鉴定出两条脂肪姪合成途径。其一存在于多数藍细菌中，主要由脂醜醜基载体蛋白 还原酶（Fatty a巧；L-ac}d carrier protein reductase, AAR)和脂肪醒脱甲醜基加氧酶 (Fatty aldehyde deformylating oxygenase, ADO)催化完成，其产物主要为直链焼姪、侧 链焼姪和帰姪（不饱和键位于碳链内部HSchirmer et al.2010)。另一途径存在于少数藍 细菌中，主要由末端帰姪合成酶（terminal olefin synthase,化巧催化完成，其产物为末端 帰姪（不饱和键位于碳链末尾）（Mendez-Perez et al.2011)。
[0006] 基于上述脂肪姪合成途径的鉴定，目前已通过基因工程改造和代谢工程优化提高 了重组藍细菌的脂肪姪产量。W集胞藻PCC 6803为例，研究结果证实，重组菌株的产量已 可达野生株的9倍W上（Wang et al. 2013)。但目前基因工程藍细菌合成脂肪姪的水平还 远未达到工业应用的水平，产姪藍细菌种质资源和基因资源的挖掘是进一步提高藍细菌脂 肪姪合成效率与丰富产姪多样性的重要因素之一。
【发明内容】
[0007] 本发明目的在于提供一种藍细菌脂肪姪合成关键基因。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0009] -种藍细菌产姪基因：产姪基因包括脂醜ACP还原酶的编码基因（aar)和脂肪醒 脱甲醜基加氧酶的编码基因（ado)。
[0010] 所述脂醜ACP还原酶的编码基因（aar)和脂肪醒脱甲醜基加氧酶的编码基因 (ado)为藍细菌 Nostoc calcicola FACHB 389，Leptolyngbya sp. NIES-30, Phormidium ambiguum NIES-2119, Chroogloeocystis siderophila NIES-1031， Calothrix sp. NIES-2101 或 Sc}ftonema sp. NIES-2130 的 aar 和 ado。
[0011] 所述脂醜ACP还原酶的编码基因（aar)和脂肪醒脱甲醜基加氧酶的编码基因 (ado)具有沈Q ID NO: 1 与 2、沈Q ID NO:3 与 4、沈Q ID NO:5 与 6、沈Q ID NO:7 与 8、沈Q ID NO:9与10或沈Q ID NO: 11与12所示的序列。
[0012] 一种构建体，构建体包含启动子，W及该启动子控制的脂醜ACP还原酶的编码基 因（aar)和脂肪醒脱甲醜基加氧酶的编码基因（ado)。
[0013] 所述构建体的启动子为来源于藍细菌的化pcB启动子或来源于大肠杆菌的T7启 动子。
[0014] 所述脂醜ACP还原酶的编码基因（aar)和脂肪醒脱甲醜基加氧酶的编码基因 (ado)为藍细菌 Nostoc calcicola FACHB 389，Leptolyngbya sp.NIES-30, Phormidium ambiguum NIES-2119, Chroogloeocystis siderophila NIES-1031, Calothrix sp. NIES-2101 或 Sc}ftonema sp. NIES-2130 的 aar 和 ado。
[0015] 一种能合成脂肪姪的基因工程菌，工程菌包含上述构建体。
[0016] 进一步的说是，将所述构建体通过转化导入大肠杆菌中。
[0017] 更进一步的说是，将所述构建体通过转化导入大肠杆菌化21 (DE3)化祀突变株 中。
[0018] 一种所述的藍细菌产姪基因作为合成脂肪姪的应用中。
[0019] 本发明所具有的有益效果：
[0020] W藍细菌作为微生物表达系统合成脂肪姪，是利用太阳能固定二氧化碳合成生物 燃料的过程。该过程是清洁生物能源的生产过程，不受原料不足的制约，不会增加碳排放。 本发明的技术方案可为上述生物能源制备过程提供有价值的候选基因资源。
[0021] 同时，藍细菌产姪关键基因（脂醜ACP还原酶/脂肪醒脱甲醜基加氧酶编码基因） 的克隆有W下重要作用；一、为从分子水平上深入研究藍细菌脂肪姪合成的代谢机制和藍 细菌胞内脂肪姪的生理功能奠定了基础。二、可了解不同藍细菌菌株的产姪特性，并解析不 同结构脂肪姪在藍细菌中的分布规律。
[0022] 因此，本发明通过广泛收集藍细菌菌种资源，并借助全基因组测序和产姪基因克 隆，旨在为用太阳能、二氧化碳和水直接合成脂肪姪的藍细菌液体燃料合成体系提供候选 种质和基因资源。
【附图说明】
[0023] 图1为基于GC-MS测定的藻株Nostoc calcicola FACHB 389的脂肪姪组成和特 性。
[0024] 图2为基于GC-MS测定的藻株Leptolyngbya sp. NIES-30的脂肪姪组成和特性。 [00巧]图3为基于GC-MS测定的藻株化ormidium ambiguum NIES-2119的脂肪姪组成和 特性。
[0026] 图 4 为基于 GC-MS 测定的藻株 Qiroogloeo巧stis siderophila NIES-1031 的脂 肪姪组成和特性。
[0027] 图5为基于GC-MS测定的藻株化lot虹ix sp. NIES-2101的脂肪姪组成和特性。
[0028] 图6为基于GC-MS测定的藻株S^tonema sp. NIES-2130的脂肪姪组成和特性。
[0029] 图7为重组载体PTZ60的基本结构。重组载体PTZ60是W 389-1/2为引物， WNostoc calcicola FACHB 389基因组DNA为模板，PCR扩增出2065bp片段，克隆入 pEASY-blunt载体，转化E. coli Transl-Tl瞻菌体抗性感受态细胞而获得。
[0030] 图8为重组载体ρΤΖ61的基本结构。重组载体ρΤΖ61是W 30-1 /2为引物， W Leptolyngbya sp. NIES-30基因组DNA为模板，PCR扩增出1949bp片段，克隆入 pEASY-blunt载体，转化E. coli Transl-Tl瞻菌体抗性感受态细胞而获得。
[0031] 图9为重组载体PTZ62的基本结构。重组载体PTZ62是W 2119-1/2为引物，W Phormidium ambiguum NIES-2119基因组DNA为模板，PCR扩增出1914bp片段，克隆入 pEASY-blunt载体，转化E. coli Transl-Tl瞻菌体抗性感受态细胞而获得。
[0032] 图10为重组载体PTZ63的基本结构。重组载体PTZ63是W 1031-1/2为引物，W Qiroogloeo巧stis siderophila NIES-1031 基因组 DNA 为模板，PCR 扩增出 19nbp 片段， 克隆入pEASY-blunt载体，转化E. coli Transl-Tl瞻菌体抗性感受态细胞而获得。
[0033] 图11为重组载体PTZ64的基本结构。重组载体PTZ64是W 2101-1/2为引物，W Calot虹ix sp. NIES-2101基因组DNA为模板，PCR扩增出183化P片段，克隆入祀ASY-blunt 载体，转化E. coli Transl-Tl瞻菌体抗性感受态细胞而获得。
[0034] 图12为重组载体PTZ65的基本结构。重组载体PTZ65是W 2130-1/2为引物，W S巧tonema sp. NIES-2130基因组DNA为模板，PCR扩增出1887bp片段，克隆入祀ASY-blunt 载体，转化E. coli化ansl-Tl瞻菌体抗性感受态细胞而获得。
[0035] 图13为重组载体ρΤΖ68的基本结构。WBamH I和化0 I酶切ρΤΖ60并回收Nostoc calcicola FACHB 389的产姪基因片段ado-aar, WBamH I和化〇 I酶切祀T2化并回收载 体部分，两者连接构建获得重组质粒PTZ68。
[0036] 图14为重组载体PTZ69的基本结构。W BamH I和化0 I酶切PTZ61并回收 Leptolyngbya sp.NIES-30 的产姪基因片段 ado-aar, WBamH I 和)(ho I 酶切祀T2化并回 收载体部分，两者连接构建获得重组质粒PTZ69。
[0037] 图15为重组载体PTZ70的基本结构。WBamH I和化0 I酶切PTZ62并回收 Phormidium ambiguum NIES-2119 的产姪基因片段ado-aar, WBamH I 和化〇 I 酶切祀T2化 并回收载体部分，两者连接构建获得重组质粒PTZ70。
[0038] 图16为重组载体PTZ71的基本结构。W BamH I和化0 I酶切PTZ63并回收 Qiroogloeoc^ystis siderophila NIES-1031 的产姪基因片