一种福寿螺抗逆相关基因海藻糖合成酶基因、其编码的蛋白质及其克隆方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及属于淡水软体动物生物技术领域，尤其设及一种福寿螺抗逆相关基因 海藻糖合成酶基因、其编码的蛋白质及其克隆方法。
【背景技术】
[0002] 福寿螺(Pomacea)又名大瓶螺、苹果螺，是国际性的恶性有害生物。该螺原产于南 美洲亚马逊河流域，上世纪80年代初期引入亚洲，因管理不善和口味不佳被弃养;福寿螺迅 速扩散到田间，部分地区泛滥成灾，对水稻、巧白等水生作物造成严重的危害。福寿螺具有 极强的繁殖力，扩散和蔓延速度快，目前已成为长江W南大部分省区的严重农业有害生物。 现今福寿螺已广泛分布在我国北缔30° W南的大部分省区，包括浙江、福建、广东、海南、广 西、云南、贵州、湖南、江西、重庆、四川、安徽省等，种群密度十分巨大，对农业生产造成严重 影响。
[0003] 在入侵过程中，由于入侵地周围环境条件的变化，福寿螺会遭受不同的逆境胁迫 (如高溫、冷冻、干燥、高渗透压及氧化作用等）。为了对抗运些逆境胁迫，生物在进化过程中 逐步形成了一些巧妙的保护机制，W维持它们的生态适应性或者保证它们能够在不利条件 下生存下来。福寿螺为了适应环境变化而面对逆境会发生不同的反应，通常是通过基因表 达的重建而改变其生理状态，包括分子伴侣(mole州lar chaperones)的合成和应激蛋白的 合成，如热激蛋白化 eat shock protein,Hsp),冷休克蛋白（Cold shock protein,Csp)和 抗冻蛋白（Anti打eeze protein,AFP)等，或者是改变酶活性、蛋白质和膜结构状态。在极端 环境条件下生物除了合成新的蛋白质外，大多数生物还能通过体内调节合成一些低分子量 共存的溶解物(如海藻糖和甘露醇等）W抵御外界环境对自身的伤害，运些小分子量物质能 维持生物膜的完整性、蛋白质的稳定性和生物活性，起到调节渗透压的作用。海藻糖是运类 低分子量共存的溶解物的典型代表，细胞内的海藻糖具有在胁迫环境(如高溫、冷冻、干燥 脱水或高渗透压等）中防止蛋白质聚集和帮助蛋白质正确折叠的功能，从而稳定细胞膜和 蛋白质的结构使细胞保持活力。海藻糖作为生物对抗环境胁迫的重要应激保护物质，在不 同的生物体中存在多种不同的合成和分解代谢途径，其相关基因被相继克隆和分析。海藻 糖的合成、分解及其调控是生物抗逆的重要机制，其相关基因的研究也是海藻糖生物工程 的重要基础。
[0004] 海藻糖既是一种胆藏性糖类，又是应激代谢的重要产物，广泛存在于细菌、酵母、 丝状真菌、植物、昆虫、无脊椎动物等生物体体内。海藻糖对生物体具有非常重要的生物学 意义，它是能源和碳源的储备物，是蛋白质和生物膜分子在脱水、高溫、氧自由基、低溫等恶 劣环境中的稳定剂和保护剂，是信号传感复合物和生长调控因子，还是某些细菌细胞壁的 组分之一。迄今已发现至少5种不同的海藻糖合成途径，分别为TPS/TPP途径、TreS途径、 TreY/化eZ途径、TreP途径和TreT途径。5种合成途径中，TPS/TPP途径在自然界中分布最为 广泛，在真核生物、真细菌和古生菌中都有发现途径应用最为广泛。海藻糖合成酶 (Trehalose-6-phosphate synthase，TPS)是海藻糖合成的限速酶。目前，已有多种昆虫的 海藻糖合成酶基因（TPS)被克隆，如埃及斑蚊
[0005] Aedes aegypti(XM_001657763)、甜菜夜蛾Spodoptera exigua(EF051258)、果蛹 Drosophila melanogaste;r(NM_134983)、棉铃虫
[0006] Helicove;rpa a;rmigera(DQ086235)、虐蚊Anopheles gambiae(EAA12459)等，但是 对其功能的研究还相对较少。最近，很多生物学家致力于开发海藻糖合成酶及海藻糖酶抑 制剂的新型农药，试图通过阻断生物体内海藻糖的分解和合成来达到控制害虫和杀菌的目 的。
[0007] 福寿螺在全国各中、低缔度均有广阔分布的重要原因是与其对溫度的耐受能力分 不开的，运也是福寿螺在新生境能够成功定殖的重要原因。Wada(2011)发现，未经冷驯化的 福寿螺在0°C下存活2d的概率不到50%，0°C下处理5d螺全部死亡；而经过冷驯化后，超过 65%的福寿螺在0°C下能存活5dW上。福寿螺的耐寒性具有季节性规律，夏季的福寿螺无法 在〇°C下存活5d，但冬季的螺在同样处理下存活率将近100%，说明福寿螺具有低溫适应机 制(Wada，2007)。我们前期的研究也发现，在6~15°C范围内，15 °C时福寿螺幼螺存活率最 高，达100% ;12°C时存活率下降至63% ;9°C时绝大部分幼螺死亡，存活率仅为7% ;6°C时无 一存活，生存时间最短为2天，最长也仅7天，平均生存时间为4.10±0.24天。此外，6°C、9°C 时的LT50分别为4天和24天。结果表明，不同低溫对幼螺生存时间的影响差异极显著(x2 = 193.31，壯=3，P<0.001)，其寿命随溫度的降低而变短。也有报道表明，福寿螺在0°C下能够 存活15~20d，-3°C下能够存活2d，-6°C条件下能存活化(Mochida，1991)，运可能与其地理 种群的分化有关(董胜张等，2010)。赵本良等(2012)首次证实了入侵我国华南地区的福寿 螺的过冷却点存在，平均在-7°C左右。福寿螺的运种过冷却防御机制有利于其适应低溫环 境，存在着进一步向北扩散的生态风险(Matsukura et曰1.，2009)。
[0008] 虽然有关海藻糖合成酶基因的研究已经比较多，大量编码海藻糖合成酶酶的cDNA 序列也得到了克隆，但是福寿螺作为一种世界性的外来入侵生物，有关福寿螺中海藻糖的 功能和作用目前尚无相关研究报道。通过本发明获得的福寿螺海藻糖合成酶基因，能为拓 展水生软体动物生理相关基因和功能的研究奠定基础，更为有效控制福寿螺扩散危害提供 理论依据和实践参考。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的解决现有技术中存在的问题，并提供一种福寿螺抗逆相关基因海藻 糖合成酶基因、其编码的蛋白质及其克隆方法。该基因名称为化TPS。具体技术方案如下：
[0010] -种福寿螺抗逆相关基因海藻糖合成酶基因，该基因具有（i)或（ii)所述核巧酸 序列之一：
[0011] (i)序列表中的SEQ ID NO:2或者其N-端缺失3-150个核巧酸残基且具有相同开放 阅读框的DNA序列；
[0012] (ii)与（i)限定的dm序列具有90%-95%W上同源性且编码相同功能蛋白质的 DNA序列。
[0013]本发明的另一目的在于提供一种福寿螺抗逆相关基因海藻糖合成酶基因编码的 蛋白质，该蛋白质具有(i)或（ii)所述氨基酸序列之一：
[0014] (i)具有序列表中SEQ ID N0:1或其N-端缺失1至50个氨基酸残基的氨基酸序列；
[0015] (ii)在(i)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加1至23个氨基酸且具有调控 淡水软体动物抗逆性功能的由（i)衍生的蛋白质。
[0016] 本发明的第Ξ个目的在于提供一种所述基因的克隆方法，包括如下步骤：
[0017] 1)取新鲜福寿螺肌肉组织50mg-100mg用DEPC水冲洗3-5次，迅速置于液氮中保存；
[0018] 2)福寿螺肌肉组织的总RNA提取:在液氮条件下将福寿螺肌肉组织研磨成细粉状， 然后转移到含有0.3-0.5mL细胞裂解液的离屯、管中；提取福寿螺肌肉组织的总RNA;
[0019] 3)反转录合成福寿螺肌肉组织的cDNA;
[0020] 4)利用CODE册P程序设计兼并引物；
[0021] 5)利用步骤4)设计的兼并引物，PCR扩增海藻糖合成酶基因中间片段cDNA序列；
[0022] 6)克隆福寿螺TPS基因的3 '端和5 '端cDNA序列；
[0023] 7)将步骤5)和6)中获得的Ξ个cDNA片段拼接获得TPS基因的全长序列。将全长目 的片段与克隆载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞，经蓝白斑筛选，挑取白色菌落进行PCR 鉴定，将阳性克隆进行测序；
[0024] 8)将目的基因通过表达载体导入原核表达系统，验证菌落对低溫的耐受力，从而 验证目的基因的功能；
[0025] 所述的细胞裂解液组成为： 异硫氯酸脈 24重量份， ,1十二繞基硫酸補 0.4重量份，
[0026] 尿素 0.4重量份， 氯化铺 0.2重量份，
[0027] 加入25重量份DEPC水，定容至50体积。
[002引所述的兼并引物序列为：上游引物5 ' -TCCACga5^taycayy t-3 '，下游引物5'- 0：17660：40：466?。日估。沈扣-3'。？0?扩增条件为94°(：预变性3111111;然后941：303,551：303， 72°Clmin，30个循环;72°C延伸10°C。；所述的大肠杆菌感受态为D册a或者JM109。所述的原 核表达系统为大肠杆菌化21表达系统。所述的表达载体为pET-20b( + )。所述的克隆载体为 pMD18-T Vector。
[0029] 本发明的有益效果是：采用上述方案，克隆入侵生物福寿螺海藻糖合成酶基因 (TPS)，获得了ITS的全长基因，测序后经Blasts比对，发现此DNA产物与其他物种来源的TPS 基因具有相似性。本发明所用的CODE册P程序，设计的兼并引物可信性强