K-15)基因 组 DNA 为模板，分别用 WyF44/WyR44、WyF24/WyR24、CK44AF/CK44AR、CK44BF/CK44BR、CK24F/ CK24R进行PCR扩增。
[0124] CK44AF:5'TGCGTTGGCGCTGTATCGG 3'
[0125] CK44AR:5 'AAGAGGACCACGCGGTGTC 3 '
[0126] CK44BF:5'CCTGGTCGAGCTACTGGG 3'
[0127] CK44BR：5'ACAGCGGCTGATCGGCAACG 3'
[0128] CK24F:5，GCTGGACGCTGCGTGGCATTT 3，
[0129] CK24R：5'GCCTCGGAGCTGAGGAAGA 3'
[0130] WyF44/WyR44扩增结果如图7的泳道4，可以看出，扩增出1114bp的特异目的条带；
[0131] WyF24/WyR24扩增结果如图6的泳道2,可以看出，扩增出1929bp的特异目的条带；
[0132] CK44AF/CK44AR扩增结果如图8所示，可以看出，扩增出1175bp目的条带，但是有拖 尾，引物特异性差。
[0133] CK44BF/CK44BR扩增结果如图9所示，可以看出，没有目的条带的扩增。
[0134] CK24F/CK24R扩增结果如图10所示，可以看出，没有明显目的条带的扩增。
[0135] 其余41个引物对采用同样的方法检测，只有本发明选择的这些引物对为扩增效果 最好的引物对。
[0136]五、引物对灵敏性分析
[0137] 以引物对WyF24/WyR24和WyF26/WyR26为例验证引物的灵敏性：
[0138] 武夷菌素产生菌（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensisCK-15)基因组 DNA浓度为200mg/ml，然后以10倍梯度进行稀释（10Q-10-5)，采用梯度稀释后的DNA为模板， 分别用 WyF24/WyR24 和 WyF26/WyR26 进行 PCR 扩增。
[0139] 结果如图11所示，左图为引物对WyF24/WyR24扩增，泳道1 -6分别为以不同浓度DNA 稀释梯度（lOtnr5)为模板扩增出的WyF26片段的特异性条带;右图为引物对WyF26/WyR26 扩增，泳道1-6分别为以不同浓度DNA稀释梯度(Π ^-ΠΓ5)为模板扩增出的WyF26片段的特异 性条带；可以看出，WyF24/WyR24引物对在DNA浓度为10- 4时，仍能够清晰地扩增出大小为 1929bp目的条带；当DNA浓度为10-5时，目的条带的清晰度会下降，说明WyF24引物对的灵敏 性能够达到10- 5;
[0140] WyF26引物对在DNA浓度为10-3时，仍能够清晰地扩增出大小为2858bp目的条带；当 DNA浓度为10-4时，目的条带的清晰度会下降，说明WyF26引物对的灵敏性能够达到ΚΓ4。
[0141]采用同样的方法，对其他42个引物对的灵敏性进行检测，均能达到10-4以上水平。 [0142]五、含有引物的试剂盒
[0143] 将表2的44对引物单独包装后，再包装得到试剂盒。
[0144] 实施例3、聚酮生物合成基因簇的扩增
[0145] 提取武夷菌素产生菌CK-15基因组DNA，分别用表2所示的44个引物对进行PCR扩 增，得到44个片段。再用DNAMAN软件将这44个片段进行拼接，得到序列89所示的聚酮生物合 成基因簇。
[0146] 上述扩增的反应体系：10XK0D plus Buffer 2.5uL，dNTP 2.5uL，DMS0(100%) 2uL，MgS〇4luL，KOD plus酶0·5uL，正反向引物（lOumol/L)各luL，DNA模板luL，无菌超纯水 补足至25uL。
[0147] 上述扩增的程序:94°C预变性5min;94°C变性3〇8,60°(：退火3〇8,68°(：延伸41^11，32 个循环;68°C延伸10min。
[0148] 每个扩增反应体系除去DNA模板的其余组分均可作为1个PCR试剂，44个引物对对 应44个PCR试剂，44个PCR试剂单独包装，再包装成试剂盒。
[0149]拼接得到序列89所示的武夷菌素生物合成基因簇，其含有的22个基因如下：
[0150] ( -）负责聚酮链骨架合成的基因，即wysI、wysJ、wysK、wysA、wysB、wysC，共6个基 因：
[0151] [l]wysl位于基因簇核苷酸序列（序列89)第5463-33974个碱基处，长度为28512个 碱基对，编码聚酮合酶，9503个氨基酸；
[0152] [2]wysJ位于基因簇核苷酸序列第33983-50275个碱基处，长度为16293个碱基对， 编码聚酮合酶，5440个氨基酸；
[0153] [3]wysK位于基因簇核苷酸序列第50331-56501个碱基处，长度为6171个碱基对， 编码聚酮合酶2056个氨基酸；
[0154] [4]wysA位于基因簇核苷酸序列第62176-66306个碱基处，长度为4131个碱基对， 编码聚酮合酶，1376个氨基酸；
[0155] [5]wysB位于基因簇核苷酸序列第66352-75930个碱基处，长度为9579个碱基对， 编码聚酮合酶，3192个氨基酸；
[0156] [6]wysC位于基因簇核苷酸序列第75950-109189个碱基处，长度为33240个碱基 对，编码聚酮合酶，11079个氨基酸；
[0157] (二）调控基因，即wysPI、wysPII、wysPIII、wysR、wysRII、wysRIII，共6个基因：
[0158] [ 1 ]wysPI位于基因簇核苷酸序列第110695-113550个碱基处，长度为2856个碱基 对，编码调控蛋白，951个氨基酸；
[0159] [2]wysPII位于基因簇核苷酸序列第113652-116442个碱基处，长度为2781个碱基 对，编码调控蛋白，2781个氨基酸；
[0160] [3]wysPIII位于基因簇核苷酸序列第116422-119205个碱基处，长度为2784个碱 基对，编码调控蛋白，927个氨基酸；
[0161] [4]wysR位于基因簇核苷酸序列第119732-120313个碱基处，长度为582个碱基对， 编码LuxR家族转录调节蛋白，193个氨基酸；
[0162] [5]wysRII位于基因簇核苷酸序列第121013-121774个碱基处，长度为762个碱基 对，编码DeoR家族转录调节蛋白，253个氨基酸；
[0163] [6]wysRIII位于基因簇核苷酸序列第121779-122801bp个碱基处，长度为1023个 碱基对，编码AsnC家族转录调节蛋白，340个氨基酸；
[0164] (三)编码转运子的基因，即wysG、wysH，共2个基因：
[0165] [l]wysG位于基因簇核苷酸序列第396-2216个碱基处，长度为1281个碱基对，编码 ABC转运蛋白，606个氨基酸；
[0166] [2]wysH位于基因簇核苷酸序列第2194-3948个碱基处，长度为1755个碱基对，编 码ABC转运蛋白，584个氨基酸；
[0167] (四）编码糖基合成与附着的基因，如WySDI、WySDII、 WySDIII，共3个基因：
[0168] [l]wysDI位于基因簇核苷酸序列第60428-61819个碱基处，长度为1392个碱基对， 编码糖基转移酶，463个氨基酸；
[0169] [2]wysDII位于基因簇核苷酸序列第59351-60409个碱基处，长度为1059个碱基 对，编码转氨酶，352个氨基酸；
[0170] [3]wysDIII位于基因簇核苷酸序列第4196-5284个碱基处，长度为1089个碱基对， 编码糖基合成酶，362个氨基酸；
[0171 ](五）其他后修饰基因及功能未知基因，即wysL、wysM、wysN、wysE、wysF，共5个基 因：
[0172] [ 1 ]wysL位于基因簇核苷酸序列第56649-57833个碱基处，长度为1185个碱基对， 编码细胞色素 P450羟化酶，394个氨基酸；
[0173] [2]wysM位于基因簇核苷酸序列第57918-58109个碱基处，长度为192个碱基对，编 码铁氧还蛋白，63个氨基酸；
[0174] [3]wysN位于基因簇核苷酸序列第58158-59309个碱基处，长度为1152个碱基对， 编码细胞色素 P450羟化酶，383个氨基酸；
[0175] [4]wysE位于基因簇核苷酸序列第109493-110242个碱基处，长度为750个碱基对， 编码硫酯酶，249个氨基酸；
[0176] [5]wysF位于基因簇核苷酸序列第1-228个碱基处，长度为228个碱基对，编码未知 功能蛋白，75个氨基酸。
[0177]因此，可以用表2所示的44个引物对检测待测链霉菌中是否含有序列89所示的聚 酮生物合成基因簇，具体方法如下:提取待测链霉菌的基因组DNA，分别用表2所示的44个引 物对进行PCR扩增，得到44个片段;再用DNAMAN软件将这44个片段拼接，若拼接得到序列89 所示的聚酮生物合成基因簇，则待测链霉菌中含有序列89所示的聚酮生物合成基因簇;若 无法拼接得到序列89所示的聚酮生物合成基