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【主权项】
1. 一种用来检测蛋白质和生物小分子的自锁式适体探针，其特征是：该探针至少包括 两个部分:对目标物具有特异性识别的3'端的适体序列和5'端的信号转导序列，所述5'端 的信号转导序列与部分适体序列杂交，形成5'端茎-环结构，所述5'端的信号转导序列包含 切刻内切酶的识别位点。2. 如权利要求1所述的探针，其特征是:该探针还包括用来连接适体序列和信号转导序 列的连接序列，所述连接序列用来参与形成5 '端茎-环结构。3. 如权利要求1所述的探针，其特征是:该探针在3 '端的适体序列还连接配合序列。4. 基于自锁式适体探针的级联扩增策略检测蛋白质或生物小分子的方法，其特征是， 包括以下步骤： (1) 链取代扩增反应:将含有目标物的待检测物与权利要求1~3中任一项所述的探针 结合，折叠成三向螺旋结构，打开5'端信号转导序列与部分3'端适体序列形成的茎-环结 构;上述体系在DNA聚合酶、切刻内切酶和dNTP存在时，发生链取代扩增反应，产生大量的引 物序列1; (2) 双重指数型扩增滚环扩增:将步骤（1)中引物序列1与模板1杂交，触发第一级指数 型RCA扩增反应，产生大量的引物序列2;引物序列2与模板2杂交，触发第二级指数型RCA扩 增反应，产生大量的G-四倍体序列，插入荧光分子后，产生荧光信号通过检测到的荧光信号 对蛋白质或生物小分子进行定量测定； 若是待检测物中不含有目标物时，不发生链取代扩增反应和双重指数型扩增滚环扩增 反应，则没有荧光信号。5. 如权利要求4所述的方法，其特征是：所述蛋白质为血小板源生长因子BB，所述生物 小分子为腺苷，所述5'端的信号转导序列如SEQ ID N〇:l所示。6. 如权利要求4所述的方法，其特征是，步骤（1)中，SDA反应的步骤为:将含有目标物的 待检测物和自锁式适体探针进行第一次孵育反应，孵育之后加入具有链置换活性的DNA聚 合酶、切刻内切酶、dNTPs、缓冲液和水进行第二次孵育反应，最后通过加热使SDA反应终止。7. 如权利要求4所述的方法，其特征是，步骤(2)中具体反应步骤为： 引物序列1与模板1杂交，在DNA聚合酶的作用下触发线性RCA反应，产生一条长的单链 DNA产物;该产物与模板1杂交，暴露出切刻内切酶的识别位点，从而被切刻内切酶切刻，产 生大量的引物序列2;而游离的引物1/模板1复合物进行下一个聚合、切刻循环，完成第一级 指数型RCA扩增;最后，引物序列2与模板2杂交，触发第二级指数扩增反应，产生大量的G-四 倍体序列，插入荧光分子后，产生荧光信号通过检测到的荧光信号对蛋白质或生物小分子 进行定量测定。8. 如权利要求4或7所述的方法，其特征是，发生RCA扩增反应之前，模板1的连接反应步 骤为：向步骤（1)中的扩增产物中加入模板1，T4DNA连接酶、T4DNA连接酶缓冲液和水，进行 连接反应。9. 如权利要求4所述的方法，其特征是:所述切刻内切酶为切刻酶Et. BbvCI，所述切刻 酶Et.BbvCI的识别位点序列为5'-GCT GAG G-3'；所述模板1的序列形成环状之后包括一段 权利要求4所述的引物序列1的互补序列和和两个权利要求4所述的引物序列2的互补序列， 各个引物序列2的互补序列之间、引物序列2的互补序列与引物序列1的互补序列之间均通 过切刻内切酶识别位点序列相连接，所述模板2的序列形成环状之后包括一段引物序列2的 互补序列和两个G-四倍体序列的互补序列，各个G-四倍体序列的互补之间、G-四倍体序列 的互补序列与引物序列2的互补序列之间均通过切刻内切酶识别位点序列相连接。10.-种检测蛋白质或生物小分子的试剂盒，其特征是：（1)权利要求1~3中任一项所 述的自锁式适体探针； (2 )DNA聚合酶、切刻内切酶、T4DNA连接酶； (3) dNTPs、荧光分子和KC1溶液； (4) Cut smart缓冲液、T4DNA连接酶的缓冲液； (5) 权利要求4所述的模板1和模板2。
【专利摘要】本发明公开了基于自锁式适体探针的级联扩增策略的生物分子检测方法，该探针至少包括两个部分：对目标物具有特异性识别的3’端的适体序列和5’端的信号转导序列，所述5’端的信号转导序列与部分适体序列杂交，形成5’端茎-环结构，所述5’端的信号转导序列包含切刻内切酶的识别位点。该探针结合链取代扩增(SDA)和双重指数型滚环扩增(DE-RCA)策略，实现了蛋白质-PDGF-BB和小分子-腺苷的超灵敏和高特异性检测，检测限分别达3.8×10-16mol/L和4.8×10-8mol/L。
【IPC分类】C12N15/115, G01N33/68
【公开号】CN105624165
【申请号】CN201610005486
【发明人】王磊, 姜玮, 李伟
【申请人】山东大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年1月5日