雄性不育突变体oss125及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物生物技术领域，具体涉及植物杂交育种方法，包括不育系繁殖和 杂交种子制备，更具体地涉及一个雄性不育突变体及其在杂交育种中的应用。 技术背景
[0002] 水稻是我国重要的粮食作物。从上世纪80年代起，W雄性不育为基础的杂交水稻 育种技术极大的提高了水稻的单产，在保障我国粮食安全中发挥关键性作用。杂交水稻制 种是用恢复系作父本和不育系杂交生产杂交种子的过程。利用作物杂种优势是提高作物产 量的重要途径，而作物雄性不育是有效利用杂种优势的前提和基础。水稻育性是影响水稻 产量的关键因素，为了提高产量和获取杂种优势，在杂交育种过程中，对雄性不育和雄性可 育的遗传操作是一个关键步骤。利用雄性不育系生产杂交种，不仅能节省大量去雄的人工， 降低种子成本，而且可W减少因去雄不净所造成的混杂，从而提高种子纯度，充分发挥杂种 优势的作用。水稻雄性不育的发现与利用为增加水稻产量，改进品质，增加抗性和适应性提 供优异种源，因而在植物育种上具有重要的应用价值。
[0003] 植物雄性不育是指在有性繁殖过程中不能产生正常可育雄配子体的遗传现象，在 广泛的开花植物中普遍存在。水稻作为模式植物，雄性生殖发育的显著特征是形成6枚雄 蕊，任何参与雄蕊发育、抱原细胞分化、减数分裂、小抱子的有丝分裂、花粉分化或开花等过 程基因的突变，均有可能引起花药发育异常，最终导致雄性不育（Ma H. Molecular genetic analysis of microsporogenesis and microgametogenesis in flowering plants. Annual Review of Plant Biology. 2005, 56:393-434.)〇
[0004] 雄性不育可W分为细胞质雄性不育(^cytoplasmic male sterility, CM巧和细胞 核雄性不育（genic male sterility, GM巧。细胞质雄性不育的实质是细胞质基因组与细 胞核基因组竞争传递自身遗传物质的结果。细胞核雄性不育由核基因突变产生，突变性状 可通过雌配子或者雄配子遗传。遗传分析表明，大多数雄性育性是由核基因控制的（Sunok M, Ki-Hong J, Do-Eun L, Dong-Yeon L, Jinwon L, Kyungsook An, Hong-Gyu K, Gynheung An. The rice FONlgene controls vegetative and reproductive development by regulating shoot apical meristem size. Molecules and Cells.2006, 21(I):147-152)。
[0005] 近年来，随着水稻基因组测序的完成，水稻突变体库的构建W及基因表达谱分析 等工作的开展，水稻花粉发育的分子机理研究起取得了一定的进展，发现了一些控制水稻 花器官数目基因，如FONl~4^、0sL服1，控制花粉囊细胞的分开和分化基因MSPUOsTDLlA， 控制雄性减数分裂基因PAIRl、PAIR2、PAIR3、MELl、MILl、DTMl、0sSG01等，促进花粉粒发育 的关键基因CYP703A3、CYP704B2、WDA1、OsNOP、DPW、U甜2、MTRl等。送些基因涉及多个方 面，包括小抱子母细胞的减数分裂、绒租层发育及降解，W及花粉细胞壁形成等方面。根据 不育基因的功能和调控时期的差异，可将水稻隐性核雄性不育基因主要分为3类；1)小抱 子母细胞发育时期不育基因；2)绒租层发育时期不育基因；3)花粉囊和花粉外壁发育时期 不育基因。
[0006] 目前水稻突变体基因克隆最常用的技术有图位克隆、同源克隆、转座子或T-DNA 标记法、表达序列标签法、差异表达基因克隆等技术。随着高通量测序技术的发展，2012 年，日本科学家提出了基于重测序方法的Mutmap基因克隆技术（Abe A, Kosugi S,化shida K,Natsume S,Takagi H, Kan-zaki H, Matsumura H, Yoshida K,Mistsuoka C, Muluneh T,Innan H, Cano L, Kamoun S,Teraushi R.Genome sequencing reveals agronomicalIy important loci in rice using MutMap. Nature Biotechnology. 2012, 30(2):174-178)， 该技术将突变体与野生型亲本进行杂交，产生Fz代分离群体，随机取20-30个突变个体，分 别提取基因组DNA，等量混合后，利用二代测序技术，结合分子生物学与生物信息学分析测 序数据，找出候选突变基因，大大缩短了基因克隆时间，降低了基因克隆成本。
[0007] 到目前为止，涉及水稻花药发育和花粉形成的一些关键基因已被鉴定和研究，送 些基因的突变导致雄性不育的表型。但对水稻雄配子体发育过程和调控机制并未完全探 明，水稻雄性不育基因的定位与克隆有助于更全面地了解雄配子体发育的分子机制，加快 利用雄性不育株系进行育种的进程。
[0008] 本研究通过EMS诱变水稻品种黄华占，筛选得到一个由单个隐性核基因控制的雄 性不育突变体，命名为OSS125,对其进行初步的表型鉴定、遗传分析及遗传背景鉴定，并利 用改进的MutMap方法（陈竹锋，严维，王娜，张文辉，谢刚，卢嘉威，简智华，刘东风， 唐晓艳.利用改进的MutMap方法克隆水稻雄性不育基因.遗传 .2014, 36(1) :85-93)，结 合HRM及基因序列分析，成功定位并克隆了该雄性不育基因。本发明还阐述了所述雄性不 育基因的应用范围和应用方法。
【发明内容】
[0009] 本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。
[0010] 除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通 技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领 域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加W限制。
[0011] 本发明包括一种育性相关基因及其核巧酸和蛋白序列，还包括通过操作该基因在 调控植株雄性生育力中的应用。非限制性地举例而言，下文描述的任何方法都可与本发明 所提供的相应核巧酸序列一起使用，例如，将所述育性基因的突变体序列引入植株W导致 植株雄性不育、使植株内源序列突变、向植株中引入该序列的反义序列、使用发卡形式、或 将其与其它核巧酸序列连接起来调控植株的表型，或者是本领域技术人员已知的可用于影 响植株的雄性生育力的多种方法中的任一方法。
[0012] 本发明利用改进的Mutmap方法克隆得到了一个雄性不育突变基因（0sS125)， 该基因与0sRPAla(L0C_0s02g53680)是等位基因。OsRPAla是一个复制蛋白 A巧巧Iication protein A，RPA)，是真核生物中高度保守的单链DNA结合蛋白，由H个亚 基 RPAl, RPA2 和 RPA3 组成的一个稳定的复合体（Wold M S. Replication protein A:a heterotrimeric, single-str曰nded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA met油olism. Annual Review of Biochemistry. 1997, 66:61-92)。在酵母和人中，RPA为DNA 代谢的多个过程所必需，如DM复制，DM修复W及同源重组等。大部分真核生物包括真菌、 昆虫和脊椎动物等编码RPA各亚基的RPA基因都只有一个，而在拟南芥和水稻中含有多个 RPA基因。水稻中含有3个RPA的旁系同源基因，包括RPAl，RPA2和RPA3。前人研究已经 在体内和体外证明它们在生化水平上可W互作，但它们确切的功能并不清楚。通过T-DNA 插入突变体研究发现，OS巧ala突变体在营养生长期中表型正常但在生殖生长期中不育。细 胞学分析表明该突变体雌性母细胞中没有形成胚囊，同时雄性母细胞在减数分裂后期I出 现异常的染色体片段，植株表现为雄性半不育和雌性完全不育。该结果说明OsRPAla在水 稻雄配子和雌配子发育过程中都起着重要作用，由于T-DNA插入对OsRPAla蛋白功能有不 同层度的影响，说明OsRPAla蛋白可能有两个功能区，分别控制雄性和雌性发育。本发明中 获得的OSS125突变体的不育性状是由于OsRPAla基因外显子上有一个氨基酸的置换，该突 变可能仅影响了 OsRPAla蛋白对雄性器官发育调控，而对雌性器官发育没有明显影响，提 示该基因在雄性器官和雌性器官中发挥作用的方式或位点