一种用于筛选具有神经保护活性的药物的细胞模型及其用途和使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种用于筛选具有神经保护活性的药物的细胞模型，属于医药生物技 术领域。
【背景技术】
[0002] 随着生命科学的快速发展，基于检测报告基因的药物筛选方法近年来取得了较大 的发展和广泛的应用，其设及完整细胞，在活细胞自然条件下研究药物对生命体功能的影 响，更接近体内的生化过程，可W较为准确地了解药物的生物学特性。
[0003] 神经纤维性病变是世界范围内死亡和长期残疾的主要原因之一，但目前尚无理想 有效的治疗药物。中医药在神经纤维性病变病上历史悠久，已有多种中药单体或有效部位 W及复方制剂在防治缺血性脑血管病上具有显著疗效。但是，中药治疗神经纤维性病变的 确切疗效成分及作用机制均不明确。因此构建神经保护相关的快速、分类筛选模型不仅有 助于从中药中寻找和发现治疗神经纤维性病变的有效药物，为新药研发提供新的先导化合 物，也可为中药治疗神经纤维性病变的作用机制研究提供一定的前期基础，有利于中医药 现代化的发展。
[0004] 神经纤维性病变的有效治疗主要设及机体适应神经元的保护/再生等，相关的功 能基因为神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)eNGF具有神经元营养和促突起生长双 重生物学功能，在神经元的损伤修复期，NGF能促进神经纤维的定向生长，促进雪旺细胞及 胶质细胞生长，修复髓銷，保护受损神经元免遭继续损害，减少神经细胞的死亡，支持神经 元的存活。鼠NGF已成为临床上常用的治疗神经损伤的药物。若一种物质能使NGF的表达上 调，则表明此物质很可能是一种很好的具有神经保护活性的药物。
[0005] 卢琼报道了基于NGF启动子构建的药物筛选模型，但并没有公开所用的基因片段 的碱基序列，本领域技术人员无从知晓此筛选模型的具体结构和构建方法(卢琼，脑缺血药 物筛选细胞模型的构建及应用研究，西南交通大学学位论文，2014年）。
【发明内容】
[0006] 为了构建一种具有神经保护活性的药物的筛选模型，本发明提供了一种基因构建 物。
[0007] 本发明提供的基因构建物从5'端到3'端依次含有:NGF启动子基因-615bp~巧0 bp序列和报告基因序列。
[000引 W大鼠为例，NGF启动子基因-615bp~巧化P序列详见沈Q NO. 1: 进一步地，上述报告基因选自：巧光蛋白基因和/或巧光素酶基因。
[0009] 优选地，上述巧光蛋白基因为绿色巧光蛋白（GFP)基因或红色巧光蛋白（RFP)基 因；上述巧光素酶基因为蛋火虫巧光素酶基因。
[0010] 红色巧光蛋白中E2-化imson较为常用。
[0011]本发明进一步提供了一种重组载体，此载体含有上述的基因构建物。
[0012]本发明中的载体指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体 细胞的一种能自我复制的DNA分子，常用的有质粒、隧菌体和动植物病毒。
[0013] 本发明进一步构建了一种稳定的细胞，此细胞含有上述的重组载体或其基因组中 整合上述的基因构建物。
[0014] 进一步地，此细胞选自HEK293细胞、化Ia细胞、C册细胞或干细胞中的任一种。
[0015] 本发明进一步提供了构建上述重组载体的方法，它包括如下步骤： (1) 合成NGF基因-615bp~巧Obp序列； (2) 将步骤(1)合成的序列与带有报告基因的报告载体分别进行酶切，连接报告载体与 启动子片段，转化大肠杆菌，抗性筛选，挑选阳性转化子，提取质粒，即得重组载体。
[0016] 进一步地，步骤(2)中，所述报告载体为带有报告基因的pSC基础质粒。
[0017] 此处所述的报告基因同上述，即选自巧光蛋白基因和/或巧光素酶基因。
[0018] 本发明进一步提供了构建上述的稳定的细胞的方法，即将上述的重组载体转染 HEK293细胞、Hela细胞、CHO细胞或干细胞中的任一种。
[0019] 本发明进一步提供了此稳定的细胞的用途，此稳定的可用于筛选可提高NGF表达 水平或具有神经保护活性的药物，如各类中药、新化学实体等等。
[0020] 本发明进一步提供了一种筛选具有神经保护活性的药物的方法，此方法包括如下 步骤： (1) 将候选药物给予本发明构建的稳定的细胞； (2) 检测所述细胞中报告基因的表达情况； (3) 判断结果，若所述候选药物能提高报告基因的表达，则表明该候选药物可提高NGF 表达水平或具有神经保护活性。
[0021] 进一步地， 步骤(1)包括将候选药物加入上述构建的稳定的细胞培养体系中共培养； 步骤(2)包括检测实验组的报告基因的表达，并与空白对照组比较，空白对照组是不添 加所述候选药物的与实验组相同条件培养的本发明构建的稳定的细胞； 若实验组中报告基因的表达水平高于对照组，表明候选药物可提高NGF表达水平或具 有神经保护活性。
[0022] 进一步优选地，实验组的报告基因的表达水平/对照组的报告基因的表达水平> 150%，则表明候选药物具有神经保护活性。
[0023] 本发明构建了 WNGF启动子为祀点的细胞筛选模型，可系统、有效、多方面地筛选 具有神经保护活性的药物，如抗神经纤维性病变的药物。
【附图说明】
[0024] 图1质粒构建示意图 图2单克隆细胞株的构建(巧光场和明场，200X ) 图3构建得到的稳定293-P化-E2细胞株(巧光场，100X) 图4红色巧光蛋白巧2)细胞模型功能鉴定(巧光场，IOOX )， A:293-p化-E2(0yM 化E);B:293-p化-E2(100yM 化E) 图5巧光素酶细胞模型(293-p化-Luc)功能鉴定 图6 5个中药提取物的筛选结果。
【具体实施方式】
[00剧材料 1.1菌株与细胞株大肠杆菌菌株DH5a(四川大学国家生物医学材料工程研究技术中屯、 505实验室保藏）、人胚肾上皮细胞皿K293(四川大学国家生物医学材料工程研究技术中屯、 505实验室保藏）。
[0026] 1.2质粒PSC-E2,即连接有报告基因E2-化imson化2)(红色巧光蛋白）的pSC质粒 (505实验室构建）、pSC-Luc，即连接有报告基因Luciferase化UC)(巧光素酶）的pSC质粒 (505 实验室构建）（构建方法参见 S Liu, L Ma, R Tan, et al. Safe and efficient local gene delivery into skeletal muscle viaa combination of Pluronic L64and modified electrotransfer.Gene Therapy(2014)21,558-565)。
[0027] I . 3主要试剂LA Taq 聚合酶（TaKaRa)、Pfu DM 聚合酶（Fermentas)、 Plalimum报Taq 聚合酶（Invitrogen);限制性内切酶（Fermentas) :MluI、Afl n、MunI、BamH I、NotI、Hind虹、XbaI;T4DM连接酶（TaKaRa);E.Z.N.A.?质粒小量提取试剂盒 化.Z.N.A.TMpiasmid Mini Kitl,Omega)、胶回收试剂盒（BioSpin Gel Extraction Kit, Bioflux);哺乳动物细胞转染试剂(；Lipofectamine?2000,Invit;rogen)、巧光素酶检测试剂 盒(Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer ,Promega)、蛋白质浓度巧|]定 试剂盒（Pierce狡 BCAProteinAssay Kit ,Thermo)、G418(Amresco)、二甲亚讽化MSO, Si卵a)、 盐酸克伦特罗(CLE，Sigma)、细胞培养皿(Thermo)、各种规格培养板(Corning);其它化学试 剂除注明外，均为国产分析纯。
[002引 1.4仪器PCR仪(S1000?Thermal 切cler，BI0-RAD)、电泳仪(DYY-虹型，北京六一仪 器厂）、凝胶成像分析系统（畑emiDoc XRS+型，BI0-RAD)、超微量分光光度计（Nanodrop 2000，化6細0 Scient if ic)、显微镜（DMIL，Leica)、倒置相差巧光显微镜（DMI4000B, LeiCa)、C02培养箱(MAC0-15AC，SANYO)、超净工作台（SW-CJ-2N型，哈尔滨东联公司）、酶标 仪（Varioskan.货Flash, Thermo Scientific)。
[0029] 实施例1重组质粒的构建 1.1试验方法 W大鼠基因组DNA为模板，设计引物在rNGF启动子序列的上下游分别引入MluI和Afin 酶切位点PCR扩增得到启动子片段JNGFpro(缩写为化）（-615bp~巧化p)(+l为基因转录起 始位点），正向引物序列见SEQ NO. 2，反向引物序列见SEQ NO. 3。1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定， 乙醇沉淀回收得到各启动子片段。分别双酶切载体PSC-E2及各启动子片段(化），1 %琼脂糖 凝胶电泳，胶回收目的片段，连接载体与启动子片段，转化大肠杆菌，氨节青霉素平板抗性 筛选，挑选阳性转化子，进行快速裂解鉴定，阳性者扩大培养后提取质粒，进行酶切和PCR鉴 定，对鉴定成功的质粒进行测序，最后获得重组质粒P化-E2。
[0030] 同理制备获得重组质粒P化-Luc。
[0031] 1.2实验结果 如图I的示意图所