F:ATGGAAAGCAAGGTAGCATATG
[0140]IAA-R:TCATACTCCACATCCCAAGCCTC[0141 ] 2)扩增第一链cDNA:操作步骤如下:
[0142]①在两个200ul离心管中分别加入2.0ul5 XFirst-Stand Buffer，I.0ul DTT,1.0ul dNTP Mix混匀，轻微离心至底部，待用；
[0143]②在另两个200ul的离心管中加入2ul总RNA，在合成5’-RACE-Ready cDNA的离心管中加入Iul 5’-Q)S Primer和0.75ul双蒸水;在合成3’-RACE-Ready cDNA的离心管中加Alul 3’-CDS Primer和1.75ul双蒸水，混合均匀，轻微离心至管底；
[0144]③对步骤②中的混合液72°C温育3min，42 °C 2min，瞬时离心；
[0145]④在合成5’-RACE-Ready cDNA的离心管中再加入Iul SMARTHA Oligo，混匀；
[0146]⑤在步骤①中的混合液中加入0.25ul RNase Inhibitor和I.0ul SMARTScribeReverse Transcriptase，混勾，PCR反应:42°C90min; 72°C 1min;
[0147]⑥加入10ul双蒸水稀释，保存在_20°C冰箱备用。
[0148]3)RACE扩增；以获得的5’-RACE-Ready cDNA和3 ’-RACE-Ready cDNA为模板分别进行5 ’和3 ’ RACE-PCR反应，扩增5 ’和3 ’ cDNA末端。RACE反应体系为50ul，内含10 X UPM 5ul、基因特异性引物Iul^PrimeSTAR Max DNA聚合酶25ul、双蒸水16.5ul、模板2.5ul AACE扩增的条件为:941€3111丨11;941€308，651€308，721€908，共30个循环；最后72°(:延伸511^11。
[0149]4)阳性片段回收;对经过步骤3)所获得的5’和3’cDNA末端扩增产物割胶回收，操作步骤如下:
[0150]①利用1%琼脂糖凝胶电泳跑完胶，再用干净的手术刀把含有目的片段的胶块切割下来，最后放入已经编好号的1.5ml离心管中；
[0151]②依据胶块重量加入3倍体积的BufferB2；
[0152]③在37°C水浴锅中水浴1min直至被完全融化；
[0153]④把融化完全的溶液移入吸附柱，12000rpm，离心lmin，然后去除收集管里面的液体，再将吸附柱继续放进同样的收集管中；
[0154]⑤参照第④步重复一遍；
[0155]⑥往吸附柱里面加入700ul的Wash solut1n，12000rpm，离心lmin，然后去除收集管里面的液体，再将吸附柱重新放到收集管里面；
[0156]⑦参照第⑥步重复一遍；
[0157]⑧将空吸附柱和收集管放入离心机，12000rpm，离心lmin;[Ο158] ⑨往吸附膜中央加入30ul Elut1n buffer，室温静置lmin，将吸附管与新的离心管放入离心机中，12000rpm，离心lmin;
[0159]⑩将DNA溶液放在-20°C下保存。
[0160]5 )PCR回收产物和PMD18-T载体连接:在PCR回收产物与载体连接前必须添加PolyA尾巴，以获得的回收产物DNA为模板，加PolyA尾反应体系为1ul:内含10 XBuffer 2.5ul，dNTP 2ul,Mg2+1.5ul，rTaq 酶 0.2ul，双蒸水 0.8ul，模板 3ul; PCR 反应条件为:72°C 延伸20min。外源DNA和质粒载体的连接反应，在200ul PCR管中反应，操作步骤如下:
[0161]①配制DNA溶液5ul:1.0ul的Pmd 18-T vector、0.1mol?0.3mol(4ul)的目的DNA;
[0162]②加入5ul的Solut1n〗，在16°C下连接过夜(10小时以上)。
[0163]6)制备感受态并转化:
[0164]感受态的制备步骤如下:
[0165]①受体菌的培养:从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5a单菌落，接种于3?5mlLB液体培养基中，37 °C下振荡培养过夜(12h左右)；将该菌种悬液以1:100的比例接种，取250ul菌液转接到25ml LB液体的培养基里面，37°C振荡培养2?3h至0D600 = 0.5左右；
[0166]②感受态的细胞制备:在超净工作台上，将细菌液体转入50ml离心管中，然后冰上放置1min;在4°C下，4000r/min，离心1min，弃去上清并将管倒置Imin以便培养液流尽；用在冰上已经预冷的0.lmol/1的CaCl2溶液1ml轻轻重悬细胞，然后冰上放置30min;O?4°C4000!'/111；[11，离心10111；[11，然后弃去上清并且加入21111预冷的0.11]101/1的03(]12溶液，再轻轻重悬细胞，必须冰上放置；
[0167]③感受态的细胞分装与冻存:在2ml已经制备完全的感受态的细胞里面加入2ml30 %甘油(即1:1体积，甘油终浓度15 % );将此感受态细胞分装成每份200yL( I.5mldorf管)，液氮速冻，快速转入-70 0C冰箱保存。
[0168]将连接过夜的产物转化，操作步骤如下:
[0169]①将感受态的细胞在冰上溶化并且加入需要转化的1ul连接产物，冰上放置30min；
[0170]②42°C水浴锅中热击45s，冰上放置2min;
[0171]③加入750ul LB(不含Amp)培养基，200rpm 37°C恒温摇床来培养Ih左右；
[0172]④4000rpm离心5min，留10ul涂板(含Amp)；
[0173]⑤37°C倒置培养12-16小时左右。
[0174]7)细菌检测:操作步骤如下:
[0175]①1.5ml离心管加入Iml LB(含Amp)培养基；
[0176]②挑取单菌落(>3个)；
[0177]③200rpm、37°C恒温摇床来培养5h左右；
[0178]④验证:以菌液为模板，菌检反应体系为25ul:内含内含1XBuffer 2.5ul、dNTP2ul、Mg2+l.5ul、rTaq酶0.2ul、上下游引物各2.5ul、双蒸水10.8ul、模板3ul。菌检反应条件为:941€3111丨11;941€308，631€308，72°(:1111丨11，共30个循环；最后72°(:延伸511^11。
[0179]⑤1%琼脂糖的凝胶电泳检测；
[0180]⑥重摇含有目的基因的菌液，测序，然后由5’和3’cDNA末端序列拼接得到全长cDNA序列ο
[0181]步骤五、CcIAA基因验证和分析:根据全长序列设计的引物，进行验证。用5’-RACE-Ready cDNA为模板进行PCR，反应体系为50ul，内含上下游引物各3ul、PrimeSTAR Max DNA聚合酶25111、双蒸水16111、模板3111。？0財广增条件为:94°(:11^11;941€308，671€308，72°(:11^1130s，共30个循环;最后72°C延伸SmiruPCR扩增后的产物割胶回收，并加PolyA尾后利用pMD-18T载体连接并测序，得到全长序列。测定得到的序列利用NCBI，DNAMAN软件搜索并对同源性进行比对以及推导氨基酸的序列；
[0182]步骤六、CcIAA基因生物信息学的分析:利用在线软件分析CcIAA蛋白质理化性质；Clustalx软件来进行序列的比对;DNAMAN软件对蛋白序列进行比对;DNAMAN软件来构建系统的进化树并进行分析；
[0183]步骤七、Ce IAA基因在转录水平上的分析:步骤如下:
[0184]I)提取山核桃不同嫁接时期嫁接茎的总RNA;
[0185]2)对内参与目的基因进行引物设计:根据CcIAA的cDNA序列，运用Primer premier5.0软件设计基因引物三对:
[0186]Aux/IAA-f-1:5’-ATGGAGATTGGATGCTGGTTGG
[0187]Aux/IAA-r-1:5’-TGGGTTGCTGTGACTTGTAGGT
[0188]Aux/IAA-f-2:5’-CTGGTTGGAGATGTTCCGTGGGA
[0189]Aux/IAA-r-2:5’-CTGGGTTGCTGTGAGTTGTAGGT
[0190]Aux/IAA-f-3:5’-CAGGCTGAGGCTGCTGGTATTTA
[0191]Aux/IAA-r-3:5’-ATTCCGACCCCTTGTAGCCTTCC
[0192]Primer premier 5.0软件设计引物:
[0193]a-F (Cc-ac t in 内参引物)5 ’ -GCTGAACGGGAAATTGTC
[0194]a-R( Cc-act in 内参引物)5 ’ -AGAGATGGCTGGAAGAGG
[0195]3)合成cDNA第一链:反转录反应体系为1ul体系，所述的反应体系如下:在200ul反应管中加入模板RNA 1.0ul,OligdT 1.0111，双蒸水6.0111，反应条件为701€51^11，冰浴1min;然后在该反应管中加入5 XReverse Transcript1n M-MLV Buffer 2.0ul,dNTP
0.5111，1?熟酶抑制剂0.25111和逆转录酶(]\1-]\0^)0.25111，反应条件为421€60111丨11，70°(:1511^11;
[0196]4)验证模版与引物:以反转录好的cDNA为模板，挑选一对合适的目的基因引物进行荧光定量RT-PCR。反应体系为25ul体系:内含上下游引物各2.5ul，10 X Buffer 2.5ul，dNTP 2ul ,Mg2+1.5ul，rTaq酶0.2ul，双蒸水10.8ul，反转录好的cDNA模板3ul ICR扩增反应条件:941€31^11;941€308，601€308，721€308，共30个循环;然后72°(:延伸51^11，1%琼脂糖凝胶电泳检测；
[0197]5)实时荧光定量PCR:采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect RealTime)试剂盒，编号TaKaRa Code:DRR041A。以反转录好的cDNA为模板，反应体系为1ul体系:内含上下游引物各0.2ul，SYBR Premix Ex TaqTM(5 X )5ul，R0X Reference DyeII (50X )0.2ul，双蒸水3.4ul，反转录cDNA模板Iul。荧光定量PCR反应条件:95°C30s; 95°C 15s，60°C 15s,共40个循环，在B1-RAD荧光定量PCR仪上进行。
[0198]步骤八、CcIAA基因在翻译水平上的表达分析:对不同时期山核桃嫁接茎上的总蛋白进行提取并检测，然后通过Western blot技术包括蛋白质电泳、转膜、免疫反应、X射线曝光和洗照片来了解CcIAA基因在山核桃嫁接过程中的翻译水平表达情况。
[0199]进一步地，所述的步骤三中的总RNA的提取步骤和步骤七中山核桃不同嫁接时期嫁接茎的总RNA的提取步骤如下:
[0200]I)在1ml离心管里面加入0.2ml的β-巯基乙醇和4ml CTAB，然后放入65°C的水浴锅中预热；
[0201]2)在样品中加入适量的PVP然后用预冷好的研棒磨细，分装在已经预热的离心管里面，每一管大约4药匙然后利用涡旋仪混匀(Imin)，然后将离心管放入65°C水浴锅中加热，期间不时上下颠倒混勾(每隔1min)加热30min，混合均勾后4°C，12000rpm，离心lOmin;
[0202]3)将离心后的上清液转入新的1ml离心管里面，再加入等体积的24:1(氯仿:异戊醇)上下颠倒混勾后4°C，12000rpm，离心1min;
[0203]4)重复第3)步，直至中间层消失；
[0204]5)将离心后的上清液转入新的1ml离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后在-20°C冰箱中静置30min?Ih;
[0205]6)将冷冻的离心管在4°C，12000rpm，离心lOmin，离心完成后将液体倒掉；
[0206]7)再加入65°C预热好的SSTE 0.3ml，待沉淀溶解完全后转入1.5ml离心管中，加入Iml Trizol，在冰上放置3min，再加入氯仿0.2ml，冰上静置5min，混合均勾后4°C，12000rpm，离心 15min;
[0207]8)将离心后的上清液装入新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，冰上放置1min，混勾后4°C，12000印111，离心10111；[11;
[0208]9)将收集到的沉淀加入处理的75 %乙醇Iml，将沉淀弹起，洗涤沉淀中的阳离子，4°C，12000rpm，离心3min;
[0209]10)将液体倒掉，再加入Iml 75%乙醇洗涤一次；
[0210]ll)4°C