用于转基因表达的载体的制作方法
【专利说明】用于转基因表达的载体
[000。 通过引用纳入
[0002] 本文引用或参考的所有文件（"本文引用的文件"），W及本文引用的文件中引用或 参考的所有文件，W及对于本文所述的或通过引用纳入任何文件中的任何产品的任何生产 商的指南、说明、产品说明书和产品页，均通过引用纳入本文，并且可用于本发明实践中。更 具体地，所有参考文献都W相同程度通过引用纳人本文，就如各文献被具体地和单独地说 明通过引用纳入本文一样。 发明领域
[0003] 本发明设及一种载体系统，其可包含替换转录后调控元件的间隔子(spacer)或填 充（Stuffer)核巧酸序列（SNS)。具体而言，本发明设及用不相关的短间隔子序列替换±拨 鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)序列，所述短间隔子序列促进感兴趣的核巧酸在逆转录 病毒载体系统中的高效表达。本发明还设及递送和表达感兴趣的核巧酸至祀细胞的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 逆转录病毒载体系统，例如慢病毒载体系统，已被建议用作递送系统。W098/17815 设及移除多个附属基因（accessoiT gene；LW099/45126设及gag-pol序列的密码子优化，作 为寻求克服Rev/RRE的输出要求并增强RNA稳定性的手段。
[0006] 乙型肝炎病毒化BV)转录后调控元件(PRE)和内含子可能是功能性等同物阳uang， Z.M.和化n，T.S.( 1995)Mol. Cell. Biol. 15:3864-386] )。±拨鼠肝炎病毒(WHV)，一种与皿 V 紧密相关的病毒，也具有PRE(本文称作WPRE;参见US 6，136,597和US 6,287,814)。在慢病 毒载体中插入WPRE导致显著增强的报告基因的表达，例如，许多不同物种的多种细胞中的 巧光素酶和绿色巧光蛋白（GFP) [Zuffer巧，R.等，（1999) J. Virol 73: 2886-2892]。刺激与 转导的细胞的周期状态无关。
[0007] WPRE包含对于其增强表达水平的功能而言重要的S种顺式作用的序列。然而，此 夕h其包含约180个碱基对(bp)的片段，其可包含WHV X蛋白开放阅读框的5'末端，及其相关 的启动子。已将全长X蛋白与肿瘤发生相关[Flajolet，M.等，（iggSU.Virol.TSienS-eiSO]。运已通过如下方式被直接证明 [1]57,419,829]:通过将614￥载体给予胎内的胎儿小 鼠：用包含野生型EIAV的载体转导的小鼠发展肝肿瘤，而用缺失WPRE的载体转导的小鼠没 有发展肝肿瘤。已知，因病毒DNA插入宿主基因组所致的myc家族癌基因的顺式活化的肿瘤 发生活性是WHV介导的癌发生的关键机制(811611山曰，1.4.(1994)刊于(：.化6〇11〇*(编），《原发 性肝癌：病因学和进展因子KPrimary liver cance;r:etiological and progression factors)，第211-224页；CRC出版社，佛罗里达州波卡拉顿；Fourel，G. (1994)刊于 F.Tronche和M.化niv(编），《肝基因表达KLiver gene e邱ression)，第297-:343页；R.G.兰 德斯公司（R.G丄andes Company),德克萨斯州奥斯汀）。此外，在人肝细胞癌中，在C末端截 短的乙型肝炎病毒X蛋白可能比全长X蛋白更具致瘤性(Tu H等.2001肝细胞癌组织中乙型 肝炎病毒X蛋白的天然COOH末端缺失的生物学影响（Biological impact of natural COOH-terminal delections of hepatitis B virus X protein in hepatocellular carcinoma tissues).Cancer Res 61:7803-7810)。
[000引 US 7,419,829设及用突变WPRE序列来替换野生型WPRE序列，所述突变WPRE序列经 设计W维持增强的转基因表达，但不表达X-蛋白。相信可对WPRE做出有限数量的变化而不 影响其增强转基因表达的能力。然而，已知逆转录病毒逆转录酶具有低保真度(平均每10， 000个逆转录的核巧酸引入一个错误）。因此，对于任何突变的WPRE而言，均有可能恢复成具 有肿瘤发生潜力的功能性野生型序列。
[0009] Real等(Appl Microbiol Biotechnol[2011]91:1581)显示，移除慢病毒载体中的 WPRE能够显著减少转基因表达，如同Ramezani等发现的那样(MoIecular l'herapy[2000]2 (5): 458) Johnson等(Gene Hierapy [2013] 20:607)显示，在转基因已经优化为高表达的慢 病毒系统中，移除WPRE对于转基因表达并无显著作用:然而，其在用填充序列替换WPRE时是 沉默的。EP1757702描述了一种丫 -逆转录病毒载体系统，其在不存在WPRE的情况下可支持 高转基因表达:同样，其也在用填充序列替换WPRE时沉默。
[0010] 该申请文件中任何文献的引用或鉴定并非承认运类文献是本发明的现有技术。
【发明内容】
[0011] 本发明的发明人现惊人地显示，用不相关短核巧酸序列替换WPRE能促进异源基因 或感兴趣的核巧酸W增强的表达水平从逆转录病毒和慢病毒表达载体表达。因此，X-蛋白 的ORF的完全移除能够除去该序列的肿瘤发生潜力，从而提高运些载体在治疗应用上的安 全性能。
[0012] 根据本发明的第一方面，提供一种工程改造的核巧酸分子，其缺失±拨鼠肝炎病 毒转录后调控元件(WPRE)，其中将间隔子核巧酸序列插入并替换WPRE。在一个优选实施方 式中，所述分离的核巧酸分子可包含SEQ ID NO: 1[TCTAGA]的序列。所述WPRE可包含X区。
[0013] 在本发明的第二方面中，提供一种逆转录病毒载体基因组，其可包含至少一种感 兴趣的核巧酸序列(NOI)和本发明第一方面所述的分离的核酸分子。
[0014] 优选地，所述逆转录病毒载体基因组可W是慢病毒载体基因组。具体而言，所述慢 病毒载体基因组可W是最小的慢病毒载体基因组。所述慢病毒载体基因组可衍生自选自下 组的病毒物种:人免疫缺陷病毒化IV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、绵羊脱髓銷性脑白质炎/羊 慢性进行性肺炎病毒(VMV)、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免 疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
[0015] 在另一个优选实施方式中，可破坏编码Rev的核酸序列或其功能等同物，从而该核 酸序列无法编码功能性Rev,或从载体基因组移除。
[0016] 在另一个优选实施方式中，可破坏编码化t的核酸序列，从而该核酸序列无法编码 功能性化t，或从载体基因组移除。
[0017] 本发明的一个优选实施方式提供一种逆转录病毒载体基因组，其可包含中屯、聚嚷 岭区（CPPT)序列。在另一个优选实施方式中，所述逆转录病毒载体基因组可包含具有ATG基 序的gag-包装信号，并且其中所述ATG基序可W是ATTG基序。
[0018] 在另一个优选实施方式中，所述逆转录病毒载体基因组可W是多顺反子，并且可 包含至少一种内部调控元件。优选地，所述内部调控元件可W是启动子，或内部核糖体进入 位点（IRES)。
[0019] 根据本发明的第=方面，提供一种用于生成逆转录病毒源性的载体颗粒的逆转录 病毒载体系统，其可包含(i)本发明第二方面所述的逆转录病毒载体基因组，（ii)编码逆转 录病毒gag和POl蛋白的核巧酸序列；（iii)编码其它必需的病毒包装组分的核巧酸序列，所 述其它必需的病毒包装组分不被(ii)的核巧酸序列编码。优选地，可W破坏，来自衍生所述 颗粒的逆转录病毒的，编码化r、Vif Jat、化f或类似的辅助基因中至少一种的，一种或多种 核酸序列，例如，该一种或多种核巧酸序列无法编码功能性化r、Vif、化t、化f或类似的辅助 蛋白，或从所述系统移除。
[0020] 优选地，所述载体系统可由异源env蛋白的至少部分而假型化(pseudotype)的。具 体而言，所述异源env蛋白可源自狂犬病-G或VSV-G。
[0021] 在本发明的第五方面中，提供由本发明的逆转录病毒载体系统产生的病毒颗粒。
[0022] 在本发明的第六方面中，提供一种已用本发明的逆转录病毒载体系统转导的细 胞。
[0023] 在本发明的第屯方面，提供一种组合物，其可包含本发明的逆转录病毒载体基因 组，W及运载体或稀释剂。
[0024] 本发明的第八方面提供一种组合物，其可包含本发明的病毒颗粒，W及运载体或 稀释剂。
[0025] 本发明的第九方面提供，将至少一种NOI递送至祀细胞的方法，所述方法可包括将 本发明的逆转录病毒载体基因组引入祀细胞，由此将NOI递送至祀细胞。
[0026] 本发明的另一个方面提供本文提供的间隔子或填充序列。
[0027] 因此，本发明的一个目的是本发明不包括任何先前已知的产品、制备产品的过程 或使用产品的方法，使得申请人保留权利并由此公开放弃任何先前已知的产品、过程或方 法。还应注意，本发明不旨在在本发明的范围内包括任何产品、制备产品的过程或使用产品 的方法，其不符合USPT0(35U. S. C. §112，第一段)或EPCKEPC的第83条）的允许要求和书面说 明，使得申请人保留权利并由此公开放弃任何先前已知的产品、制备产品过程或使用产品 的方法。
[0028] 应注意，在该公开文件W及特别在权利要求和/或段落中，诸如"包含"等的术语具 有美国专利法中对其赋予的含义，例如，其可表示"包括"等;且诸如"基本由……组成"的术 语具有美国专利法中对其赋予的含义，例如，其允许未明确列出的要素，但排除发现于现有 技术中或影响本发明基本或新颖性的要素。
[0029] 公开了运些和其他实施方式，其在下述发明详述中明显并包括于其中。
[0030] 附图的简要说明
[0031] W下发明详述W示例的形式给出但不旨在单独将本发明限制为所述特定实施方 式，其最好可连同所附附图进行理解。
[0032] 图1是称为祀LNS-NY-ESO ADB152的原始转移质粒的示意图。
[0033] 图2是称为pELNS-NY-ESO NoX ADB693的质粒的示意图。已对pELNS-NY-ESO ADB152质粒的WPRE区进行修饰，W移除3'端的截短的X-蛋白和X-启动子。
[0034] 图3是称为pELNS-NY-ESO NoW ADB694的质粒的示意图。已对pELNS-NY-ESO ADB152质粒的WPRE区进行修饰，W用6个核巧酸(TCTAGA)(即，XbaI限制性酶切位点）替换 WWE 区。
[0035] 图4是称为祀LNS Tomato-Luc ADB73的质粒的示意图。
[0036] 图5是称为祀LNS Luc ADB678的质粒的示意图。
[0037] 图6是称为祀LNS LucNoX ADB679的质粒的示意图。
[0038] 图7是称为祀LNS LucNoW ADB680的质粒的示意图。
[0039] 图8显示，Luc、LucNoX和LucNoW慢病毒载体制备物中存在的慢病毒载体相关的 p24gag衣壳蛋白的水平。
[0040] 图9显示，用Luc、LucNoX和LucNoW载体的连续稀释物转导的SupTl细胞中的巧光素 酶活性的表达。
[0041 ] 图10显示，来自称为BufT504、BufT505、Buff506和Buf巧07的四种不同供体的 SupTl和原发性T细胞中的巧光素酶活性的表达。
[0042] 图11显示，由包含全长WPRE或WPRE替换性填充序列的表达巧光素酶的转基因质粒 衍生的LV转导的SupTl细胞表达的巧光素酶活性。
[0043] 图 12显示，NYESO-I TCR在用NY-ESOl、NY-ES01 WPRE NoX或NY-ESOl NoW 6聚体的 连续稀释物转导的SupTl细胞表面上的表达。
[0044] 发明详述
[0045] 现将通过非限制性示例的方式描述本发明的多种优选特征和实施方式。尽管，一 般而言，本文中提及的技术是本领域熟知的，具体可参见Sambrook,等，《分子克隆，实验室 手册KMolecular Cloning，A LaboratoiT Manual)(1989)，和Ausubel等，《分子生物学简 要方案》（化ort Protocols in Molecular Biology) (1999)第4版，约翰威利父子出版社公 司（John Wiley&Sons，Inc. KW及《现代分子生物学方案》（Current Protocols in Molecular Biology)的完整版）。
[0046] 本文所用术语"操作性地连接"表示所述组分处于某种关系中，该关系允许其W所 需方式发挥功能。
[0047] ±拨鼠肝炎病毒(WHV)转录后调控元件(WPRE)可增强从多种不同载体类型（包括 慢病毒载体）的表达[US 6,136,597;6,287,814;Zufferey，R.等.（1999)J.Virol.73:2886-92]。不意在受理论限制，认为该增强归因于转录后水平上的改善的RNA处理，导致核转录本 的水平增加。mRNA稳定性的两倍增加也促进了运一增强[Zufferey，R.，等.同上]。经报道， 包含WPRE的转录本的增强的蛋白质表达水平是不包含WPRE的那些的大致2至5倍，并且与转 录本水平的增加呈良好相关。运已采用多种不同的转基因证明（2证'6丘67，1?.，等.同上）。
[0048] WPRE包含对于其增强表达水平的功能而言重要的S种顺式作用的序列。此外，其 包含约18化P的片段，其可可包含WHV X蛋白ORF的5 '端(全长ORF是42化P)，及其相关的启动 子。始于X启动子的转录本的翻译会导致形成代表X蛋白的N出末端的60个氨基酸的蛋白质。 该截短的X蛋白可促进肿瘤发生，具体而言，在将该截短的X蛋白序列整合进入宿主细胞基 因组的特定基因座时，可促进肿瘤发生[Bal sano，C.等，（1991)Biochem.Biophys Res.Commun.176:985-92;Flajolet，M.等，（1998)J.Virol.72:6175-80;Zheng，Y.W.等， (1994)J.Biol.Chem. 269