Cell Lines Derived from Tumors of 化e Head and Neck, Cancer Res 48， 2858， 1988 非专利文献 17:Brattain, M.，Marks，M.，McCombs，J.，Finely, W.，and Brattain, D.: Characterization of Human Colon Carcinoma Cell Lines Isolated From a Single Primary Tumour, Br J Cancer 47， 373， 1983 非专利文南犬 18:Friedman， E.， Higgins， P.， Lipkin， M.， Shinya, H.， and Ge lb， A.: Tissue Culture of Human Epithelial Cells from Benign Colonic Tumors, In Vitro 17， 632， 1981 非专利文南犬 19:Leung， C.， and Shiu, R.: Morphological and Proliferative Characteristics of Human Breast Tumor Cells Cultured on Plastic and in Collagen Matrix, In Vitro 18， 476， 1981 非专利文南犬 20: Creasey， A.， Smith， H.， Hackett, A.， Fukuyama， K.， Epstein， W.， and Madin， S.: Biological Properties of Human Melanoma Cells in Culture, In Vitro 15， 342， 1979 非专利文南犬21 :Lasfargues， E.: Tissue Culture Methods/Applications， Kruse， P.， and Patterson, M.， Academic Press, 45， 1973。
【发明内容】
[000引 发明要解决的课题 但是，通过^往的方法从来自生物组织的样品配制的细胞，即使要使其增殖，也偶尔存 在不按期待增殖的情况。另外，由于存在只能从生物获得少量来自组织的样品的情况，因此 希望来自样品的细胞的获得效率高。因此，本发明的目的是，W高效率从来自生物组织的样 品获得增殖性高的细胞。
[0009] 用于解决课题的手段 本发明人等经过努力研究发现，在用于使来自生物组织的样品分散所使用的组合物中 包含的、被认为促成组织的可溶化的膜蛋白酶妨碍胶原酶、其它有用酶的作用。另外发现， 在膜蛋白酶活性高的情况下，细胞毒性高，使获得的细胞的增殖性降低。W W上的发现为基 础进一步努力研究，本发明人等发现，通过使用与W往使用的组合物不同、抑制膜蛋白酶活 性且确保胶原酶活性高的组合物使来自生物组织的样品分散，能够W高效率获得增殖度高 的细胞。在来自生物组织的样品的分散不充分的情况下，存在细胞的获得效率低的倾向，W 往，一直使用显示高膜蛋白酶活性的组合物，进行细胞分散。相反，本发明发现，通过使膜蛋 白酶活性降低，能够提高增殖度高的细胞的获得效率，因此是突破性的发明。
[0010] 也即，在第1实施方式中，本发明提供用于使生物组织分散的组合物，所述组合物 的处方溶液中的胶原酶活性通过FALGPA分解活性测定的方法测定为0.30U/mL-10U/mL，所 述组合物的处方溶液中的膜蛋白酶活性通过BA邸水解活性测定的方法测定为0U/mk30U/ ITlL O
[0011] 另外，在第2实施方式中，本发明提供第1实施方式中记载的组合物，其用于药剂评 价。
[0012] 进一步地，在第3实施方式中，本发明提供第1实施方式或第2实施方式中记载的组 合物，其中生物组织是癌组织。
[0013] 进一步地，在第4实施方式中，本发明提供来自生物组织的细胞的获得方法，其包 含将来自生物组织的样品W第1实施方式-第3实施方式中任一项记载的组合物处理。
[0014] 进一步地，在第5实施方式中，本发明提供细胞的培养结果的评价方法，其中培养 的细胞是W第1实施方式-第3实施方式中任一项记载的组合物处理的细胞。
[0015] 另外，在第6实施方式中，本发明提供第5实施方式中记载的方法，其中细胞的培养 结果是2维的培养结果。
[0016] 另外，在第7实施方式中，本发明提供第5实施方式中记载的方法，其中细胞的培养 结果是3维的培养结果。
[0017] 另外，在第8实施方式中，本发明提供第7实施方式中记载的方法，其中3维的培养 在滴块状凝胶内进行。
[0018] 进一步地，在第9实施方式中，本发明提供用于实施第4实施方式或第5实施方式中 记载的方法的试剂盒，其包含第1实施方式-第3实施方式中任一项记载的组合物。
[0019] 发明的效果 如果使用本发明的组合物处理来自生物组织的样品，能够有效地分散样品，能够W高 效率获得附着于周围的组织量少、且酶毒性造成的伤害少、与生物内同样地增殖的细胞。特 别地，如果使用本发明的组合物，能够从硬癌等硬度高的组织W高效率获得增殖度高的细 胞。如果将使用本发明的组合物获得的细胞立体地增殖，或W形成凝集块的3维培养法培 养，则由于细胞与生物内同样地增殖，能够进行抗癌剂等药剂的评价，基因、蛋白质、糖链等 功能性高分子等的生物物质的分析等各种分析。进一步地，如果将使用本发明的组合物获 得的细胞在滴块状凝胶中包埋培养，则可从更少量的细胞进行各种分析。
【附图说明】 [0020] 【图1】图1是对比疑似间质组织的消化效率的照片。
[0021] 【图2】图2是对比组合物对肥T-116细胞W及PC-14细胞的毒性的图。
[0022] 【图3】图3是对比使用包含酶的组合物配制的细胞的增殖性的照片。
[0023] 【图4】图4是对比通过包含酶的组合物处理后的细胞的增殖性的图。
[0024] 【图5-1】图5是对比通过包含酶的组合物处理后的细胞对各种药剂的感受性的图。
[0025] 【图5-2】图5是对比通过包含酶的组合物处理后的细胞对各种药剂的感受性的图。
[0026] 【图6】图6是关于实施例1的组合物与比较例1的组合物的T/C(%)值的1比1图。
[0027] 【图7】图7是对比将包含酶的组合物处理得到的细胞在滴块状凝胶中培养后进行 中性红染色的结果的照片。
【具体实施方式】 [002引 本发明提供用于使生物组织分散的组合物。本发明的组合物的处方浓度下的胶原酶活 性通过FALGPA分解活性测定的方法测定为0.30U/mkl0U/mL，优选地为0.30U/mkOT/mL，更 优选地为0.30U/mg-lU/mg。此处，对于FALPGA分解活性测定的方法，在后述试验例2中，将使 用示为FALGPA分解活性测定的方法的方案测定的值(U/mL)作为胶原酶活性。FALGPA是N-(3-[2-巧喃基]丙締酷基)-Leu-Gly-Pro-Ala。另外，本发明的组合物的处方浓度下的膜蛋 白酶活性通过BA邸水解活性测定的方法测定为0U/mk30U/mL，优选地为0U/mk20U/mL，更 优选地为0U/mレ10U/mL。对于BA趾水解活性测定的方法，在后述试验例2中，将使用示为 BAEE水解活性测定的方法的方案测定的值化/mU作为膜蛋白酶活性。BAEE是Na-苯甲酯基-k精氨酸乙醋盐酸盐。处方浓度是使用本发明的组合物使生物组织分散时的本发明的组合 物的浓度。
[0029] 本发明的组合物可如下制备:将市售的胶原酶、分散酶、透明质酸酶等混合，通过 FALGPA分解活性测定的方法、W及BA邸水解活性测定的方法，分别测定混合物的胶原酶活 性W及膜蛋白酶活性，并将混合物中胶原酶活性W及膜蛋白酶活性调整至期望的范围。作 为胶原酶，可使用来自梭菌属、来自放线菌等的任一。另外，胶原酶的纯化度可使用任一，但 期望含有粗纯化的胶原酶。另外，本发明的组合物中也可包含透明质酸酶、脱氧核糖核酸 酶、弹性蛋白酶、分散酶、嗜热菌蛋白酶等各种分解酶。更优选地，包含分散酶。分散酶能够 分解在生物中作为细胞的支架的IV型胶原蛋白、纤连蛋白，因此能够更有效地获得细胞。另 夕h为了控制膜蛋白酶活性，本发明的组合物也可包含膜蛋白酶活性的抑制剂。膜蛋白酶活 性的抑制剂可列举血清等。通过应用血清，可使本发明的组合物中的细胞毒性降低。
[0030] 本发明的组合物可用于处理来自生物组织的样品，使该样品分散，获得细胞。作为 生物，除了人，可列举小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、犬、猫、绵羊、猪、山羊、牛、猴等非人哺乳动 物等。作为生物组织，例如可列举，癌组织、正常组织等。作为癌症，例如可列举，消化器官 癌、头颈癌、乳癌、肺癌、癌性胸?腹膜炎、宫颈癌、子宫体癌、卵巣癌等。本发明的组合物尤其 适于硬癌的消化W及分散。来自生物组织的样品例如可列举，手术材料的全部或一部分、活 组织检查样品的全部或一部分等。手术材料例如可使用W治疗为目的的外科切除术时摘出 的组织。另外，可使用W病理诊断、疾病的治疗W及病程预后的判定等为目的由低侵袭性采 集法W试验切除?试验穿刺方式采集的组织。作为由低侵袭性采集法采集的组织，可列举各 种活组织检查样品、胸腔镜下或腹腔镜下材料、由腹水W及胸水等获得的样品等。样品也可 从生物采集后接受用剪刀、綴子W及剌刀等的细切处理等机械分离处理。另外，样品也可使 用含有培养基成分、抗生素的洗涂液洗涂。另外，样品也可通过从癌症患者采集后的切碎处 理成为糊状。
[0031] 来自生物组织的样品的分散可如下进行，例如，将本发明的组合物与来自生物组 织的样品混合，在25-4(TC处理3分钟-72小时。更优选地，来自生物组织的样品的分散可通 过处理5分钟-24小时而进行。混合时来自生物组织的样品的含量例如为0.1-5g/10mL。混合 时的胶原酶活性通过FALGPA分解活性测定的方法测定为0.30U/mL-10U/mL，优选地为 0.30U/mL-抓/mL，更优选地为0.30U/mL-lU/mLDFALGPA分解活性测定的方法如前述。混合时 的膜蛋白酶活性通过BA邸水解活性测定的方法测定为0U/mk30U/mL，优选地为0U/mk20U/ mL，更优选地为OU/mkl OU/mL。FALGPA分解活性测定的方法如前述。
[0032] 分散后，可使用任意方法，从本发明的组合物与来自生物组织的样品的混合物获 得细胞。为了使本发明的组合物中包含的酶造成的细胞毒性降低，并使获得的细胞的增殖 性提高，优选地，用血清处理包含来自生物组织的样品的分散后的混合物。另外，为了降低 酶的作用，也可使用抓TA等金属嵌合剂处理。进一步地，为了除去酶，也可通过离屯、分离去 除酶液。获得细胞时，也可使用尼龙网、细胞滤过器等滤器进行过滤。另外，也可将分散了来 自生物组织的样品的溶液接种在培养基上进行培养，选择性获得增殖的细胞。培养也可用 载体进行。接种来自生物组织的样品的载体也可W层状包被细胞粘附因子。作为细胞粘附 因子，可优选地列举各种类型的胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、巧粘着蛋白、 明胶、肤W及整联蛋白等细胞外基质，运些可W使用仅1种，也可联