一种含海藻寡糖重金属生物修复剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及重金属生物修复应用技术领域，尤其是涉及一种含海藻寡糖重金属生 物修复剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 我国重金属污染问题日益严峻，2014年的全国土地污染情况调查报告指出，部分 土壤污染严重，耕地土壤环境质量堪忧，工矿业废弃地土壤环境问题突出，污染以无机型为 主，无机污染物镉（Cd)、汞（Hg)、铜（Cu)、铅（Pb)、铬（Cr)、锌（Zn)、镍（Ni)等8种重金属 污染程度最严重，其中重金属Cd点位超标率达到了 7. 0 %，是重金属污染物中点位超标率 最高的。中科院院士赵其国教授在"2015重金属污染治理峰会"上指出，我国受重金属污 染的耕地约有1000万公顷，占18亿耕地的8%以上，每年直接减少的粮食产量约100亿公 斤。由于重金属污染具有隐蔽性、滞后性，形态多样性，且在物质循环和能量循环中难以分 解，容易蓄积在土壤中，导致作物减产，并通过植物的根系吸收进入植物体内，再经过食物 链的传递和富集而危害人体健康。因此土壤重金属污染已成为全球面临的一个严重环境问 题（邢艳帅等，2014)。
[0003] 目前，土壤重金属污染的治理方法主要有两种方式：一是降低土壤中重金属的生 物有效性，减少植物对重金属的吸收；二是通过工程或生物技术方法降低土壤中重金属的 含量。后者因工程量大、成本高，不适合大面积的土壤重金属修复。改变土壤中重金属存在 形态，降低土壤有效态重金属的含量是土壤重金属修复的主要方法。重金属污染修复方法 有物理修复法（电动修复法、电热修复法）、化学修复法（土壤淋洗法、化学固定技术）和生 物修复法（植物修复法、动物修复法和微生物修复法）（梁家妮等，2009)。物理修复法和化 学修复法修复效果好，但是成本高，且易造成二次污染，不适于大面积土壤重金属修复。微 生物修复法是利用微生物对土壤中的重金属污染物的吸收、沉淀、氧化还原等作用降低土 壤重金属含量，或使污染物无害化的过程。微生物修复法具有成本低、污染少等优点，再加 上国家政策倾斜，使其成为了重金属污染土壤修复的重要方向（乔志香等，2004)。中国专 利CN102240670A提供一种重金属污染土壤的微生物修复方法，该球形红细菌微生修复剂 能一定程度上降低植物体内重金属积累，但施用时将发酵液直接随水漫溉重金属土壤，保 质期较短，存在着应用效果稳定性差等问题；同时施用量为50~200mL/kg 土壤，换算成亩 施用量为7500~30000L (-亩地耕层土壤质量约为150000kg)，用量大，成本较高。中国专 利CN103275728A提供一种土壤重金属生物固定剂，在有机肥中添加纳豆芽孢杆菌、胶质芽 孢杆菌、巨大芽孢杆菌和康氏木霉菌四种菌，制备方法复杂，成本较高；而且采用的菌株虽 然对重金属有吸附效果，但据相关报道指出，巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌因代谢过程中产 生有机酸，对土壤重金属起到溶解活化作用，能提高土壤有效态重金属含量，促进植物吸收 重金属（杨卓等，2009 ;王小敏等，2013 ;杨榕等，2015);对重金属作用效果不一样的菌株 复配，造成修复效率的下降，成本提高。
[0004] 海藻寡糖是由海藻多糖降解得到的聚合度在2~10的直链或支链化合物，以琼胶 寡糖（agaro-oligosaccharide，AOS)和褐藻寡糖（alginate-derived oligosaccharide， ADO)等为代表。海藻寡糖具有抗氧化、调节植物生长，提高植物抗逆性，减少植物病虫害发 病率的作用（Kang et al.，2014 ;Zhang et al.，2013)，作为新型绿色环保生物肥在农业生 产中起到重要作用。此外，海藻寡糖分子中含有大量的羧基、羟基，带有电负性，能够通过离 子交换和络合作用吸附重金属，因此在土壤重金属污染的治理方面显现出一定的潜力。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对现有技术存在的上述问题，提供不仅制备方法简单，环境 污染小，而且能有效降低土壤中有效态重金属含量，阻止植物对根系周围重金属离子的吸 收，同时能改良土壤，促进植物生长的一种含海藻寡糖重金属生物修复剂及其制备方法。
[0006] 所述含海藻寡糖重金属生物修复剂各组分的质量百分比为：海藻寡糖5%~ 15%、枯草芽孢杆菌发酵液10%~20%、淡紫拟青霉固态发酵物65%~85%;其中，有效活 菌数彡2亿CFU/g。
[0007] 所述含海藻寡糖重金属生物修复剂的制备方法，包括以下步骤：
[0008] 1)制备枯草芽孢杆菌发酵液
[0009] 配制营养琼脂平板，将枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis)三炬-07接种在 营养琼脂平板上进行划线培养，从营养琼脂平板上将活化好的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis)三炬-07用无菌生理盐水洗涤，制成菌悬液，将菌悬液接种至种子培养基中培 养，得种子液，再将种子液接种至发酵罐培养基中发酵，得枯草芽孢杆菌发酵液；
[0010] 2)制备淡紫拟青霉固态发酵物
[0011] 配制PDA培养基，将淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus)三炬03号种孢 子液，涂布于营养琼脂平板上培养，再用无菌生理盐水将营养琼脂平板上的淡紫拟青霉 (Paecilomyces lilacinus)三炬03号种的孢子洗涤，制成孢子悬液；将孢子悬液接入种子 培养基中培养得种子液；将种子液接种至固体发酵培养基中，于28~32°C下培养1~2d后 翻盘一次，前3d保持湿度为70%~80%，后4d保持自然湿度，发酵7d后，孢子成熟，固体 发酵结束，固体发酵培养基经常温干燥后粉碎，制得淡紫拟青霉固态发酵物；
[0012] 3)制备含海藻寡糖重金属生物修复剂
[0013] 将海藻寡糖、步骤1)所得枯草芽孢杆菌发酵液、步骤2)所得淡紫拟青霉固态发酵 物混合，即得含海藻寡糖重金属生物修复剂。
[0014] 在步骤1)中，所述营养琼脂平板的组成可为牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠 5g/L、琼脂20g/L，灭前pH值为7. 3 ;所述枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis)三炬-07,已 于2014年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册 编号：CGMCC No. 10248 ;所述划线培养的条件可于28~32°C条件下培养24~48h ;
[0015] 所述种子培养基的组成可为牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，灭菌前pH值 为7. 0 ;所述菌悬液接种的接种量按体积百分比可为菌悬液的5%，菌悬液0D_= 0. 84 ;所 述种子培养基中培养的条件可于30~35°C，150~200rpm条件下培养24~36h ;
[0016] 所述发酵培养基的组成可为淀粉20. 0~30. 0g/L，蔗糖5. 0~10. 0g/L，豆柏粉 10~20g/L，磷酸氢二钾2. 0~3. 0g/L，硫酸锰0. 1~0. 5g/L，酵母膏1. 0~2. 0g/L ;所述 种子液接种至发酵罐培养基中发酵的接种量按体积百分比可为种子液的10% ;所述发酵的 条件可为：转速控制在200~300rpm，通气量控制在为lvvm，保持溶解氧10%以上，罐温控 制在28~30°C，罐压保持在0. 05~0. 06MPa，pH值通过10%氨水和10%盐酸控制在6. 5， 发酵时间为36~72h。
[0017] 在步骤2)中，所述PDA培养基的组成可为：去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼 脂15g/L，自然口!1值；所述淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus)三炬03号种，已于2010 年6月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072， 保藏编号为CCTCC NO :M 2010165 ;所述涂布于营养琼脂平板上培养的条件可于28~32°C 条件下培养3~5d ;所述种子培养基的组成可为：蔗糖15g/L，大豆粉10g/L，磷酸二氢钾 lg/L，硫酸锌0. lg/L，灭菌前pH值为6. 0 ;所述将孢子悬液接入种子培养基的接种量按体积 百分比可为8%~15%，稀释至0D_为0. 2 ;所述将孢子悬液接入种子培养基中培养的条件 可于28~32°C，150~200rpm下培养3~4d ;所述固体发酵培养基的组成可为：麸皮、秸 杆粉末、玉米粉、硫酸铵，麸皮、秸杆粉末、玉米粉、硫酸铵按质量比可为（70~80) : (15~ 20) : (10~15) : (0.5~1.0);所述将种子液接种至固体发酵培养基的接种量可将种子 液以100mL/kg的比例接种至固体培养基中。
[0018] 在步骤3)中，所述海藻寡糖是利用微生物直接降解龙须菜、马尾藻、褐藻等藻类 植物中至少一种