一种核壳结构的磁性纳米粒子及其制备与应用的制作方法

本发明涉及生化分析技术领域，尤其涉及一种核壳结构的磁性纳米粒子及其制备与在血清肿瘤标志物的提取和质谱分析中的应用。

背景技术：

细胞表面跨膜糖蛋白例如CD44作为一种肿瘤标志物在临床精确诊断和治疗方面显示了很好的特异性和灵敏度，由于在血清中样品复杂和低丰度原因，肿瘤标志物的检测很大程度上依赖有效的提取技术如免疫测定和抗原抗体结合。然而免疫测定却存在一些限制：由于抗原抗体的特异性，因而免疫测定的分析通量是中等的；免疫测定无法提供目标蛋白的结构信息、序列和翻译后修饰等信息；抗体纯化和高花费也限制了免疫测定的广泛推广；由于抗体自身脆弱而导致储存、运输和最终运用上的缺陷；因此，一种高通量、高灵敏、高选择的血清肿瘤标志物的提取和分析检测方法亟待开发。

技术实现要素：

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种核壳结构的磁性纳米粒子，其能对血清肿瘤标志物进行快速的提取，便于质谱分析。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种核壳结构的磁性纳米粒子，该磁性纳米粒子的核为铁氧化物，壳为二氧化硅，磁性纳米粒子的表面用透明质酸钠修饰，经透明质酸钠修饰的磁性纳米粒子的粒径范围为350-1000nm。

进一步地，上述铁氧化物为Fe₃O₄。

本发明还提供了该核壳结构的磁性纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、在氯化铁溶液中加入乙醇、己烷和油酸，常温下搅拌，随后加入氢氧化钠置于70-80摄氏度下4-5小时，待溶液分层后收集上层的油酸铁，去离子水洗干净，蒸干己烷，然后将油酸铁加入到油酸中，室温下充氮气30-35分钟，加热至400-450摄氏度，30-35分钟充氮气保护，冷却至室温，加入过量乙醇，离心收集上清液，再次溶于己烷和乙醇中，重复3-5次，获得磁性铁氧化物纳米材料；

步骤2、将聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚加入到环己烷中超声20-25分钟，加入步 骤1中得到的磁性铁氧化物纳米材料并且不断搅拌，加入氨水和四乙基原硅酸盐放置16-24小时，离心，洗涤并重新溶解在乙醇中，干燥保存备用；

步骤3、将步骤2中得到的纳米材料溶解在甲苯中，并加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，超声10-20分钟后在室温下搅拌24小时，离心收集，用去离子水洗涤，烘干备用；

步骤4、用磁铁吸附步骤3中得到的核壳结构的磁性纳米粒子，将该核壳结构的磁性纳米粒子加入到去离子水中，得到第一溶液；另取一容器，在其中加入去离子水，将羟基琥珀酰亚胺、透明质酸钠和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解在去离子水中，得到第二溶液；将第一溶液和第二溶液混合，调节pH值至9.0-9.2，在37-38摄氏度下搅拌过夜，通过磁铁分离得到经透明质酸钠修饰的所述磁性纳米粒子。

本发明还公开了上述核壳结构的磁性纳米粒子在血清肿瘤标志物的提取中的应用，包括以下步骤：

步骤1、根据上述制备方法制备经透明质酸钠修饰的磁性纳米粒子；

步骤2、从全血中分离血清，在血清中加入步骤1中得到的经透明质酸钠修饰的磁性纳米粒子；

步骤3、通过磁铁从血清中富集血清肿瘤标志物。

进一步地，血清肿瘤标志物为CD44蛋白。

本发明还提供了上述核壳结构的磁性纳米粒子在血清肿瘤标志物的质谱分析中的应用，包括以下步骤：

步骤1、根据上述制备方法制备经透明质酸钠修饰的磁性纳米粒子；

步骤2、从全血中分离血清，在血清中加入步骤1中得到的经透明质酸钠修饰的磁性纳米粒子；

步骤3、通过磁铁从血清中富集血清肿瘤标志物；

步骤4、清洗步骤3中得到的血清肿瘤标志物，加入蛋白酶进行酶解；

步骤5、用质谱仪进行检测，并对结果进行分析，得出结论。

进一步地，血清肿瘤标志物为CD44蛋白，蛋白酶为胰蛋白酶。

进一步地，上述步骤2中，血清的体积小于等于20-40μL。

进一步地，上述步骤4中，酶解溶液的pH值范围为4～11，温度范围为20～50摄氏度。

进一步地，上述质谱仪为电喷雾质谱仪。

基于本发明合成的透明质酸钠修饰的磁性纳米粒子结合质谱技术可以快速实现血清肿瘤标志物如一些细胞表面跨膜糖蛋白的提取和部分序列鉴定，从而实现高分子量化合物高效、快速的检测。本发明作为一种快速高效的检测手段，值得推广和应用。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1是本发明血清中CD44蛋白提取耦合质谱检测的流程图；

图2是本发明较优实施例中得到的材料的扫描电子显微镜图片和透射电子显微镜图片，图2a是透射电子显微镜图片，图2b是扫描电子显微镜图片；

图3是高置信水平和低置信水平下直接检测血清的液相色谱-质谱图，图中为CD44的多肽TNPEDIYPSNPTDDDVSSGSSSER(m/z＝1285.04041,+2)的二级质谱图，星号代表被鉴定的CD44的肽段。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行进一步描述。

透明质酸钠修饰的核壳结构的磁性纳米粒子可按下述步骤合成：

步骤1、将2.0～2.3克氯化铁溶于6-8毫升水中，在氯化铁溶液中加入乙醇、己烷和油酸，常温下搅拌约30分钟，随后加入0.2-0.3克氢氧化钠置于70-75摄氏度下4-5小时，待溶液分层后收集上层的油酸铁，去离子水洗干净，放置在90-100摄氏度蒸干己烷，然后将粘稠状的油酸铁加入到0.4-0.5毫升的油酸中，室温下充氮气30-40分钟，加热至400-450摄氏度，30-35分钟充氮气保护，冷却至室温，加入过量乙醇，离心收集上清液，再次溶于己烷和乙醇中，重复3-5次，获得磁性铁氧化物纳米材料；

步骤2、将0.5-0.6克聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚加入到12毫升环己烷中超声20-30分钟，加入步骤1中得到的磁性铁氧化物纳米材料1.25毫克并且不断搅拌，加入0.2-0.25毫升氨水(质量分数25％)和0.29-0.31毫升的四乙基原硅酸盐放置16-24小时，离心，洗涤并重新溶解在乙醇中，最后干燥保存备用；

步骤3、将步骤2中得到的纳米材料250-260毫克溶解在50-60毫升甲苯中，并加入1-1.2毫升的3-氨丙基三乙氧基硅烷，混合物超声10-15分钟后在室温下搅拌24-36小时，离心收集，用去离子水洗涤三次，然后在真空干燥箱60-70摄氏度放置5-6小时烘干备用；

步骤4、用磁铁吸附步骤3中得到的核壳结构的磁性纳米粒子200毫克，加入到30-35毫升的去离子水中，另取一容器，在其中加入20-22毫升的去离子水，将6.0-7.0毫克的羟基琥珀酰亚胺、23.5-24.5毫克的透明质酸钠和7.7-8.1毫克的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解其中，将两种溶液混合，调节pH值至9.0-9.2，在37-38摄氏度下搅拌过夜，通过磁铁分离得到经透明质酸钠修饰的磁性纳米粒子，并用去离子水洗涤三次，最终溶解在纯水中以备 后续实验(10毫克/毫升)。

配制2mg/mL的核壳结构的磁性纳米粒子，超声震荡10分钟，在铜网和铝箔上制样，电子显微镜图像采用JEOL2011显微镜。扫描电子显微镜图像采用JEOL飞利浦XL30显微镜。

其扫描电子显微镜图片和透射电子显微镜图片如图2所示。

在较优的实施例中，磁性纳米粒子的粒径为150～800nm，选用500nm粒径的材料进行实验。

本发明中，通过磁铁从血清中富集被磁性纳米粒子捕获的血清肿瘤标志物，用25mM,pH～8.0的碳酸氢铵缓冲液清洗材料1～3次，去除材料上非特异性吸附的蛋白质，然后加40mg/mL胰蛋白酶溶液在核壳结构磁颗粒材料中原位快速酶解。磁性分离收集酶解产物，进行质谱分析。

实施例1：核壳结构的磁性纳米粒子对血清中表面跨膜糖蛋白CD44的提取和质谱分析。

配制2μg/μL级别的血清溶液，将核壳结构的磁性纳米粒子在该溶液中孵育15～30分钟，在磁力作用下将捕获了目标蛋白的核壳结构的磁性纳米粒子从溶液中分离出来。重悬于生理盐水中，加入胰蛋白酶快速酶解，所得酶解产物冷冻干燥保存，进行电喷雾质谱分析，可有效鉴定分析该蛋白，鉴定的部分CD44肽段如图3所示。可见使用本发明提供的方法，可以快速有效地分离提取CD44蛋白，并进行质谱分析。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。