一种识别氯丙醇酯的纸基荧光印迹复合材料及其制备方法与流程

本发明涉及食品安全领域，具体涉及一种用于识别氯丙醇酯的纸基荧光印迹复合材料及其制备方法。

背景技术：

氯丙醇酯类化合物是丙三醇的羟基被一个或二个氯取代形成化合物的总称。然而，氯丙醇类化合物不仅以游离形式存在，而且还以与脂肪酸结合的酯类形式存在，后者的含量远远高于游离态氯丙醇酯，由此国内外开始关注氯丙醇酯的健康危害。目前，虽然没有直接证据表明食品中氯丙醇酯本身对人群健康的危害，但其在肠道胰脂酶作用下释放出的氯丙醇所引起的遗传毒性和肾脏毒性已引起广泛关注。欧共体委员会食品科学分会已经认定氯丙醇类物质是一种致癌物，其最低阈值应为不得检出为宜。

目前，随着国内外对氯丙醇酯污染问题的重视，食品中氯丙醇酯残留检测研究取得了很大进展，主要通过将氯丙醇酯全部转换为游离态氯丙醇酯进行检测，即：提取-水解-中和-净化-衍生化-色谱/质谱检测6个过程。然而，常规分析方法需要大型、昂贵的仪器设备、复杂的前处理操作和衍生化技术、必备的专业技术人员，长的分析周期，不适合氯丙醇的现场检测。因此，开发新型的氯丙醇酯现场快速分析，就必须解决两大难题：①样品前处理极为繁琐、干扰因素较多，影响测定结果的准确性；②氯丙醇酯极性大、沸点高，难以直接进样分析，需要复杂的衍生化反应，且无紫外响应基团、分子量又低，质谱痕量检测时容易导致高性噪比和低灵敏度。

分子印迹技术是将模板分子与功能单体接触时形成的多重作用点通过聚合过程记忆下来，当洗脱模板后，聚合物中就形成了与模板分子空间构型相匹配的具有多重作用点的孔穴，从而对模板分子表现出高选择性识别能力。在此基础上，分子印迹荧光复合材料集荧光响应和分子识别特性为一体，洗脱模板分子后残留的印迹孔道有利于荧光信号的产生。

但是，目前尚未见到有文献报道氯丙醇酯印迹聚合物的制备，仅有两篇文章报道了氯丙醇印迹聚合物。li等采用甲基丙烯酸为单体，制备出氯丙醇印迹聚合物，最大吸附容量为9.6mg/g，选择性识别因子仅为4.4(analbioanalchem,2014,406:6319-6327)。leung等采用4-乙烯基苯硼酸酯为单体，制备出氯丙醇印迹聚合物，最大吸附容量为13.5mg/g(analyticachimicaacta,2003,491:15-25)。

究其原因，发明人发现并非没有人尝试进行氯丙醇酯印迹聚合物的制备，只是氯丙醇酯的构型较为特殊，分子结构庞大(含有一个脂肪酸分子)，结构复杂，采用通常的分子印迹聚合物制备方式所得到的吸附容量和识别因子都难以满足检测需求。

技术实现要素：

因此，针对上述问题，本发明提供了一种能够对氯丙醇酯进行快速、便捷地检测的检测材料及其制备方法。该检测材料具有高吸附容量和识别因子。

具体而言，本发明提供一种识别氯丙醇酯的纸基荧光印迹复合材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤a)、利用氯金酸溶液和牛血清白蛋白溶液制备纳米金/牛血清白蛋白；

步骤b)、在滤纸上滴涂纳米金/牛血清白蛋白并修饰引发剂；以及

步骤c)、以氯丙醇酯为模板制备分子印迹膜。

在一种优选实现方式中，

所述步骤a)包括：

步骤a1)、将相同体积的氯金酸溶液和牛血清白蛋白溶液混合均匀；

步骤a2)、将步骤a1制备的混匀溶液置于30-40℃水浴锅中，剧烈搅拌1-10min后加入1-5ml的naoh溶液；

步骤a3)、持续搅拌直至溶液变为深橘色，停止水浴；

步骤a4)对所获得的纳米金/牛血清白蛋白复合材料进行离心、用水洗涤3-5次。

在另一种优选实现方式中，

所述步骤b)包括：

步骤b1)、将步骤a)中所获得的纳米金/牛血清白蛋白分散到水溶液中，然后滴涂在滤纸表面形成荧光/滤纸材料，纳米金/牛血清白蛋白滴涂量为滤纸质量的1-10％；

步骤b2)、烘干水分后，将步骤b1获得的荧光/滤纸浸泡到3-氯丙基三甲氧基硅烷丙酮溶液中(质量浓度为5-30％)，60-90度条件下反应4-8小时；

步骤b3)、将滤纸浸泡在二乙基二硫代氨基甲酸钠的乙醇溶液中(摩尔浓度0.1-1mol/l)，10-30度条件下反应10-20小时，将引发剂修饰在滤纸材料表面。

在另一种优选实现方式中，

在所述步骤a1)中，氯金酸和牛血清白蛋白均采用纯水配制溶液，二者的质量比1：1-10，在所述步骤a2)中所加入的naoh溶液的浓度为0.5-5mol/l。

另一方面，本发明提供一种磁性荧光分子印迹材料，其特征在于，所述纸基荧光印迹复合材料是采用上述制备方法制备的。

另一方面，本发明提供一种识别氯丙醇酯的方法，其特征在于，所述方法包括：

采用所述的方法制备纸基荧光印迹复合材料；

利用上述纸基荧光印迹复合材料进行氯丙醇酯的检测。

优选地，所述步骤c)包括：

步骤c1)、将模板氯丙醇酯、功能单体甲基丙烯酸和1-乙烯基咪唑溶解在10-100ml丙酮溶液中，超声孵育1-3小时；

步骤c2)、将步骤b)中所获得的引发剂修饰荧光/滤纸材料，插入到步骤c1的溶液中，加入交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯，在紫外灯下照射聚合4-10小时；

步骤c3)、用甲醇/乙酸溶液洗去模板氯丙醇酯后，得到纸基荧光印迹复合材料；

优选地，在所述步骤c1)中，模板氯丙醇酯、甲基丙烯酸和1-乙烯基咪的摩尔比为1：0.5-5：0.5-5，在所述步骤c2)中，所述二甲基丙烯酸乙二醇酯为10-30mm，在所述步骤c3)中，乙酸在甲醇中的体积比小于20％。

本发明将高选择性仿生识别与高灵敏荧光响应集成在低廉滤纸表面，建立一种快速、便捷、低廉、灵敏、准确分析氯丙醇酯。

本发明以甲基丙烯酸和1-乙烯基咪唑为单体，首次制备氯丙醇酯的印迹聚合物，最大吸附容量达到129.8mg/g，选择性识别因子为6.4，说明咪唑基团的引入有助于构筑高选择性印迹孔穴。本发明所制备分子印迹材料的吸附容量和识别因子都远高于现有氯丙醇类印迹聚合物的吸附容量和识别因子。

附图说明

图1示出了本发明的纸基荧光印迹复合材料的电镜图和能谱分析；

图2示出发明的纸基荧光印迹复合材料的制备方法的示意性流程图；

图3示出了纸基荧光印迹复合材料(mips)和纸基荧光非印迹复合材料(nips)的吸附性能评价结果；

图4示出了纸基荧光印迹复合材料(mips)和纸基荧光非印迹复合材料(nips)的吸附动力学评价结果；

图5示出了纸基荧光印迹复合材料(mips)和纸基荧光非印迹复合材料(nips)的选择性识别评价结果；

图6示出了基于纸基荧光印迹复合材料的实际样本中氯丙醇酯的检测范围；

图7中示出了甲基丙烯酸和1-乙烯基咪唑的比例与吸附容量和印迹因子之间的关系。

具体实施方式

以下结合附图及其实施例对本发明进行详细说明，但并不因此将本发明的保护范围限制在实施例描述的范围之中。

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本实施例中，纸基荧光印迹复合材料的制备的具体步骤如下：

将5ml的氯金酸水溶液(5mg/ml)和5ml的牛血清白蛋白水溶液(50mg/ml)混合均匀，置于37℃水浴锅中剧烈搅拌2min，随后加入1mol/l的naoh溶液(1ml)；持续搅拌直至溶液变为深橘色，停止水浴加热。将获得的纳米金/牛血清白蛋白复合材料进行离心、用水洗涤3-5次后，再次分散到水溶液中。随后滴涂在滤纸表面形成荧光/滤纸材料，滴涂量为滤纸质量的1％。烘干水分后，将荧光/滤纸材料浸泡到3-氯丙基三甲氧基硅烷丙酮溶液中(质量浓度为10％)，60度条件下反应6小时；取出滤纸，再次浸泡在二乙基二硫代氨基甲酸钠的乙醇溶液中(摩尔浓度0.5mol/l)，25度条件下反应10小时，将引发剂修饰在滤纸材料表面。

将模板氯丙醇酯、功能单体甲基丙烯酸和1-乙烯基咪唑溶解在50ml丙酮溶液中，三者的摩尔比为1：2：2，超声孵育1小时后，将引发剂修饰的滤纸/荧光材料插入溶液中，并加入20mm的二甲基丙烯酸乙二醇酯，在紫外灯下照射聚合6小时。用10％的乙酸甲醇溶液洗去模板氯丙醇酯后，得到纸基荧光印迹复合材料。纸基荧光非印迹复合材料的制备与纸基荧光印迹复合材料制备过程类似，只是不加入模板氯丙醇酯。

采用扫描电镜和能谱分析技术对实施例1制备的材料进行分析(图1)。电镜结果说明由于表面聚合技术，分子印迹聚合物薄膜只生长在滤纸纤维表面，仍具备纤维膜的多孔结构，有助于快速质量传递。印迹聚合物修饰滤纸的薄膜较为致密，而且呈现颗粒状结构，预示着功能单体/模板离子预聚物的存在。而由于模板分子的缺失，非印记聚合物表现为杂乱无章的颗粒排布，吸附性能较低。能谱分析说明：相比于空白滤纸，纳米金/牛血清白蛋白复合材料修饰的滤纸显示出金元素的存在，预示荧光材料的修饰，能够实现目标物的检测。随后，通过硅烷化实现引发剂的修饰，制备的复合材料显示出si、cl和s元素的存在。通过模板诱导的分子印迹聚合，纸基荧光印迹复合材料表面au、si、cl和s元素的存在，峰形显著降低，预示新的聚合物薄膜的存在。

将实施例1制备的材料插入到不同浓度(0-100mg/l)的氯丙醇酯溶液中，振荡10小时后，采用气相色谱法检测上清液中目标物的含量，进而计算出纸基荧光印迹复合材料对氯丙醇酯的吸附容量(图3)。结果显示：迹复合材料对氯丙醇酯的吸附容量随着浓度的升高而逐步增强，当氯丙醇酯的浓度达到100mgl^-1时，吸附容量趋于平衡，且其吸附量远大于纸基荧光非印迹复合材料，说明mips含有与氯丙醇酯的立体结构相吻合的印迹孔穴和固定排列的功能基团，而nips中的功能基团随机排列，因而对模板分子表现出高选择性吸附能力。langmuir等温吸附模型拟合结果显示，纸基荧光分子印迹复合材料的理论最大吸附量为qm＝129.8mg/g，是纸基荧光非印迹复合材料吸附容量的6.4倍；

将实施例1制备的材料插入到100mg/l的氯丙醇酯溶液中，在振荡的不同时间段，采用气相色谱法检测这个时间段上清液中目标物的含量，进而计算出纸基荧光印迹复合材料对氯丙醇酯的吸附动力学(图4)。结果表明：纸基荧光分子印迹复合材料在45min后吸附量基本达到平衡，表现出极快的吸附速率，具有较好的实际应用前景。

为了评价纸基荧光印迹复合材料对氯丙醇酯(3μg/ml)的选择性识别能力，利用氯丙醇、丙三醇、1,2-丙二醇,1,3-二氯丙醇、2,3-二氯丙醇作为干扰物质，加入十倍于目标物质浓度的上述干扰物，使干扰物的终浓度为30μg/ml。如图5所示，十倍于氯丙醇酯浓度的结构类似物的吸附容量为氯丙醇酯的25％，mip/nip吸附量的比值变化很小。这说明纸基荧光分子印迹复合材料对目标物质氯丙醇酯具有良好的选择性，制备过程中形成了与氯丙醇酯模板在功能团分布、尺寸、分子结构上完全相同的精致的三维空穴结合位点，实现复杂介质中目标物质的痕量检测。

本研究制备出集现场分析、荧光响应、分子识别为一体的新型多功能复合材料，建立一种集萃取/富集/检测一体化的氯丙醇酯快速检测新技术，实现奶制品中氯丙醇酯的痕量、便捷、灵敏检测(图6)。在最佳的试验条件下，氯丙醇酯浓度在20-1200ng/ml的范围内与荧光强度呈良好的线性关系，存在两条线性范围，相关系数r²＝0.9908和0.9938。

实施例2

本实施例中纸基荧光印迹复合材料制备的具体步骤如下：

将5ml的氯金酸水溶液(5mg/ml)和5ml的牛血清白蛋白水溶液(5mg/ml)混合均匀，置于30℃水浴锅中剧烈搅拌1min，随后加入0.5mol/l的naoh溶液(1ml)；持续搅拌直至溶液变为深橘色，停止水浴加热。将获得的纳米金/牛血清白蛋白复合材料进行离心、用水洗涤3-5次后，再次分散到水溶液中。随后滴涂在滤纸表面形成荧光/滤纸材料，滴涂量为滤纸质量的1％。烘干水分后，将荧光/滤纸材料浸泡到3-氯丙基三甲氧基硅烷丙酮溶液中(质量浓度为5％)，60度条件下反应4小时；取出滤纸，再次浸泡在二乙基二硫代氨基甲酸钠的乙醇溶液中(摩尔浓度0.1mol/l)，10度条件下反应10小时，将引发剂修饰在滤纸材料表面。

将模板氯丙醇酯、功能单体甲基丙烯酸和1-乙烯基咪唑溶解在10ml丙酮溶液中，三者的摩尔比为1：0.5：0.5，超声孵育1小时后，将引发剂修饰的滤纸/荧光材料插入溶液中，并加入10mm的二甲基丙烯酸乙二醇酯，在紫外灯下照射聚合4小时。用甲醇溶液洗去模板氯丙醇酯后，得到纸基荧光印迹复合材料。纸基荧光非印迹复合材料的制备与纸基荧光印迹复合材料制备过程类似，只是不加入模板氯丙醇酯。

采用本实施例的方法同样可以获得纸基荧光印迹复合材料。

实施例3

本实施例的纸基荧光印迹复合材料制备的具体步骤如下：

将5ml的氯金酸水溶液(5mg/ml)和5ml的牛血清白蛋白水溶液(50mg/ml)混合均匀，置于40℃水浴锅中剧烈搅拌10min，随后加入5mol/l的naoh溶液(5ml)；持续搅拌直至溶液变为深橘色，停止水浴加热。将获得的纳米金/牛血清白蛋白复合材料进行离心、用水洗涤3-5次后，再次分散到水溶液中。随后滴涂在滤纸表面形成荧光/滤纸材料，滴涂量为滤纸质量的10％。烘干水分后，将荧光/滤纸材料浸泡到3-氯丙基三甲氧基硅烷丙酮溶液中(质量浓度为30％)，90度条件下反应8小时；取出滤纸，再次浸泡在二乙基二硫代氨基甲酸钠的乙醇溶液中(摩尔浓度1mol/l)，30度条件下反应20小时，将引发剂修饰在滤纸材料表面。

将模板氯丙醇酯、功能单体甲基丙烯酸和1-乙烯基咪唑溶解在50ml丙酮溶液中，三者的摩尔比为1：5：5，超声孵育3小时后，将引发剂修饰的滤纸/荧光材料插入溶液中，并加入30mm的二甲基丙烯酸乙二醇酯，在紫外灯下照射聚合10小时。用19％的乙酸甲醇溶液洗去模板氯丙醇酯后，得到纸基荧光印迹复合材料。纸基荧光非印迹复合材料的制备与纸基荧光印迹复合材料制备过程类似，只是不加入模板氯丙醇酯。

采用本实施例的方法同样可以获得纸基荧光印迹复合材料。

本发明以甲基丙烯酸和1-乙烯基咪唑为单体，首次制备氯丙醇酯的印迹聚合物，而且聚合方法通过步骤(b)中的各步过程保证了印迹识别位点分布在纸基材料表面，解决了模板分子不容易洗脱的难题。本发明进一步优化甲基丙烯酸和1-乙烯基咪唑的比例，发现咪唑基团的引入有助于提高印迹材料的吸附容量和印迹因子(说明选择性识别)。当甲基丙烯酸和1-乙烯基咪唑的摩尔比为2/2时，纸基印迹复合材料的选择性达到最大值。

图7中示出了甲基丙烯酸和1-乙烯基咪唑的比例与吸附容量和印迹因子之间的关系，其中吸附容量用柱状图表示，印迹因子用三角形表示。

虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在本发明保护范围之内。