一种健脾温中、散寒止泻的药物组合物中有效成分的测定方法及指纹图谱建立方法与流程

本发明涉及药品检测领域，尤其是涉及一种中成药的高效液相色谱检测。

背景技术：

由丁香、肉桂、荜茇三味中药组成的药物组合物丁桂儿脐贴，具有温中健脾、散寒止泻的功效。《中国药典》中没有记载该品种的质量检测标准。现有的标准中存在不足为：薄层鉴别中丁香、肉桂及荜茇方法各不相同，有机溶剂消耗量大，污染环境，检测时间长，并且完全不能定量，对产品的质量可控性差。

中国专利201210035570.5改进了其质量检测的方法，但是该方法侧重于对本药物组合物主要成分的定性鉴别和定量检测，缺乏对药物整体质量的控制。

因此，需要提供一种新的、快速、准确并且适合工业化大生产需求的所述药物组合物的质量控制方法。

技术实现要素：

为了解决上述至少一个技术问题，本发明提供了一种健脾温中、散寒止泻的药物组合物中有效成分的测定方法，以及利用这种方法建立相应指纹图谱的方法。

根据本发明的一些实施例，一种健脾温中、散寒止泻的药物组合物中有效成分的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备：称取桂皮醛对照品，加甲醇制得对照品溶液。(2)供试品溶液的制备：取所述药物组合物，粉碎，过筛，加入甲醇溶液，提取1～2小时，放至室温，加入甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液。(3)测定法：吸取对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，其中，

高效液相色谱仪的色谱条件如下：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：流动相a为甲醇，流动相b选自甲酸，磷酸或乙酸，进行梯度洗脱，梯度程序如下表

流动相的流速为0.8-1.2ml/min，柱温25-40℃，检测波长：244～264nm。

本发明所选择的检测条件是经过实验反复比较和验证的，和现有技术比较，具有准确度高，可以实现半定量测定的特点。

根据本发明的实施方式之一，其中，步骤(1)中对照品溶液中桂皮醛的浓度0.1mg/ml。

根据本发明的另一实施方式，其中，步骤(1)和(2)中甲醇的浓度为70～100％。优选地，步骤(1)和(2)中甲醇的浓度分别为100％和75％。

根据本发明的又一实施方式，其中，步骤(2)中所述药物组合物经粉碎、过筛后加入甲醇，使得每100ml提取溶剂中所含药粉为1g～5g。

根据本发明的另一实施方式，步骤(2)中提取方法为加热回流提取。

根据本发明，步骤(3)中流动相b的浓度为0.2％。进一步地，流动相b可以为0.2％甲酸。

根据本发明的实施方式之一，最优选的梯度洗脱程序可以为：

根据本发明的实施方式之一，色谱柱为agilentzorbaxsb-c18柱。

根据本发明的优选实施方式，色谱柱的柱温优选30℃。

根据本发明的优选实施方式，流动相的流速优选1ml/min。

根据本发明的优选实施方式，检测波长优选为254nm。

根据本发明的另一方面，一种健脾温中、散寒止泻的药物组合物高效液相指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备：称取桂皮醛对照品，加入浓度为70～100％的甲醇制得对照品溶液。(2)供试品溶液的制备：取所述药物组合物，粉碎，过筛，加入浓度为70～100％的甲醇溶液，使得每100ml提取溶剂中所含药粉为1g～5g，加热回流提取1-2小时，放至室温，加入浓度为70～100％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液。(3)获得色谱图：以对照品溶液作为参照物，将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，其中，

所述高效液相色谱仪的色谱条件如下：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相a为甲醇，流动相b选自甲酸，磷酸或乙酸，进行梯度洗脱，梯度程序如下表

流动相的流速为0.8-1.2ml/min，柱温25-40℃，检测波长为244～264nm。

(4)生成对照指纹图谱：选择合格的多批所述药物组合物色谱图，以桂皮醛为参比峰，得到12个共有峰的图谱，按中位数法计算生成标准对照指纹图谱，其中，指纹图谱相对保留时间为：

发明人发现，桂皮醛色谱峰在供试品指纹图谱中峰面积所占比例相对较大，且经多个样品实测，结果显示其相对稳定，因此选定6号峰桂皮醛作为丁桂儿脐贴指纹图谱的参照物。本发明所得标准指纹图谱参见附图23。

本发明第一次采取hplc指纹图谱对该品种进行检测，经过对流动相和梯度洗脱条件等方法进行优化，使得图谱的主峰分离良好，同时对照峰的峰形也明显变好，可以全面控制本品的整体质量，同时满足工业化大生产的要求。通过本发明提供的方法建立的该品种标准指纹图谱，可以为本品种的国际化提供良好的质量标准。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1根据本发明提供方法所得对照品指纹图谱；

图2根据本发明实施例所得供试品指纹图谱；

图3根据本发明实施例210～350nm待测样品色谱图；

图4根据本发明不同波长下待测样品色谱图；

图5不同浓度和种类的提取溶剂所得供试品色谱图；

图6不同提取方式所得供试品色谱图；

图7不同提取时间所得供试品色谱图；

图8不同品牌色谱柱所得供试品色谱图；

图9不同柱温所得供试品色谱图；

图10不同流速所得供试品色谱图；

图11确定色谱信息采集时间所得供试品色谱图；

图12采用乙腈-水流动相所得供试品色谱图；

图13采用甲醇-水流动相所得供试品色谱图；

图14采用甲醇-0.2％甲酸流动相所得供试品色谱图；

图15采用甲醇-0.2％磷酸流动相所得供试品色谱图；

图16采用甲醇-0.2％乙酸流动相所得供试品色谱图；

图17系统适用性试验指纹图谱；

图18重复性试验指纹图谱；

图19中间精密度试验指纹图谱；

图20稳定性试验指纹图谱；

图21仪器耐用性试验指纹图谱；

图22色谱柱耐用性试验指纹图谱；

图23根据本发明所提供的标准指纹图谱。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。

实施例1指纹图谱建立

1.1仪器

agilent1260高效液相色谱仪，岛津lc-20at高效液相色谱仪，agilent1200高效液相色谱仪，色谱柱(agilentzorbaxsb-c18，4.6×250mm，5μm，s/n:uscl060354)，色谱柱(agilentzorbaxsb-c18，4.6×250mm，5μm，s/n:uscl058060)，色谱柱(agilentzorbaxsb-c18，4.6×250mm，5μm，s/n:uscl036549)，色谱柱(agilentzorbaxsb-c18，4.6×250mm，5μm，s/n:uscl059648)，色谱柱(phenomenexgemiric18，4.6×250mm，5μm，s/n:695685-14)，色谱柱(thermoods-2hypersil，4.6×250mm，5μm，s/n:0905415n4)，色谱柱(inertsilods-3，4.6×250mm，5μm，s/n:1a7143425)，色谱柱(unitaryc18，4.6×250mm，5μm，s/n:z2013112901)。

1.2试剂

试剂：甲酸(ar，国药集团化学试剂有限公司)，冰醋酸(ar，国药集团化学试剂有限公司)，磷酸(ar，北京精求化工有限责任公司)，纯水(杭州娃哈哈集团有限公司)，甲醇(ar，国药集团化学试剂有限公司)，甲醇(hplc，honeywell)。

对照品：丁香酚对照品(110725-200711，纯度99.3％，中检所)，桂皮醛对照品(110710-201016，纯度98.6％，中检所)，胡椒碱对照品(0775-200203，纯度100％，中检所)。

1.3检测样品

丁桂儿脐贴(批号：151012、151013、151014、151015、151016、151020、151065、151066、151067、151069)，亚宝药业集团股份有限公司提供。

1.4测试方法

照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定。

对照品溶液的制备取各对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取丁桂儿脐贴，剪碎，混匀。取1g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，取出，放至室温，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：agilentzorbaxsb-c18250mm×4.6mm，5μm)；以甲醇为流动相a，0.2％甲酸溶液为流动相b，按下表进行梯度洗脱：

检测波长254nm；柱温30℃；流速1.0ml/min；理论板数按桂皮醛峰计算应不得低于10000。

测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录90分钟的色谱图。结果见图1，2。

附图1为对照品指纹图谱，根据丁桂儿脐贴各药味所含化学成分，选择丁香酚、桂皮醛、胡椒碱作为参照物进行成分确认。附图2可见供试品色谱图中，呈现与桂皮醛对照品色谱峰保留时间一致的色谱峰，并应呈现12个与对照指纹图谱相对应的特征峰。由供试品指纹图谱和对照图谱比较可知，6号峰为桂皮醛(保留时间为：37.7min)，7号峰为丁香酚(保留时间为：47.2min)，8号峰为胡椒碱(保留时间为：56.0min)。其中桂皮醛色谱峰在供试品指纹图谱中峰面积所占比例相对较大，且经多个样品实测，结果显示其相对稳定，因此选定6号峰桂皮醛作为丁桂儿脐贴指纹图谱的参照物(s)。

实施例2最佳色谱条件考察

仪器和试剂同实施例1。

2.1检测波长的选择

采用pda检测器对供试品进行检测，考察样品色谱峰信息，筛选检测波长。

供试品溶液的制备：取本品，剪碎，混匀。取1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(500w，40khz)30分钟，取出，放至室温，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

采用agilentzorbaxsb-c18色谱柱，柱温30℃，流速0.8ml/min，甲醇为流动相a，水溶液为流动相b，按下表进行梯度洗脱。进样10ul，采集时间150min。

比较样品在210nm-350nm内色谱图，230nm-270nm波段内色谱吸收比较丰富且基线平稳，见图3。比较样品在234nm(a)、244nm(b)、254nm(c)、264nm(d)处色谱峰情况，见图4。254nm的指纹图谱信息量比较多，能够更加充分地体现本品的化学成分，且基线漂移不大。丁桂儿脐贴的处方有丁香、肉桂、荜茇三味，其质量控制成分分别为丁香酚、桂皮醛和胡椒碱，这三种成分最大吸收在280nm～343nm之间。综合比较上述三种成分在254nm处均有吸收且图形较好，故优选检测波长为254nm。

2.2供试品溶液的制备考察

对照品溶液的制备和测定法同实施例1。

(1)提取溶剂浓度考察

取药贴(批号151012)，剪碎，混匀。取6份，各1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入无水乙醇、甲醇、75％甲醇、50％甲醇、25％甲醇、水50ml，密塞，称定重量，超声处理(500w，40khz)1小时，取出，放至室温，再称定重量，分别用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(agilentzorbaxsb-c18色谱柱，柱长为250mm，内径为4.6mm，s/n:uscl060354)，以甲醇为流动相a，0.2％甲酸为流动相b，按下表进行梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长为254nm；柱温为30℃。

精密吸取供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。结果见表1、图5。

表1不同浓度和种类的提取溶剂所得色谱峰面积

由上表可知，75％甲醇为溶剂提取时，所获取指纹图谱信息量较多，峰响应值较大，故最优选75％甲醇为提取溶剂。

(2)提取方式考察

取本品(批号151012)，剪碎，混匀。取2份，各1g，精密称定，分别置具塞锥形瓶和圆底烧瓶中，分别精密加入75％甲醇50ml，密塞，称定重量，一份超声处理(500w，40khz)1小时，另一份水浴加热回流1小时，取出，放至室温，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定方法同(1)。结果见表2、图6。

表2不同提取方式所得色谱峰面积

由上表可知，采用回流提取时，所获取指纹图谱信息量较多，峰响应值较大，故优选回流提取。

(3)提取时间考察

取本品(批号151012)，剪碎，混匀。取3份，各1g，精密称定，分别置圆底烧瓶中，分别精密加入75％甲醇50ml，称定重量，分别水浴加热回流0.5小时、1小时、2小时，取出，放至室温，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定方法同(1)。结果见表3、图7。

表3不同提取时间所得色谱峰面积

由上表可知，回流1小时即可获得最多的信息量，峰响应值也较大，故优选回流1小时。

将以上制备方法所得到的色谱图中主要色谱峰进行积分，对比各保留时间下的峰面积，选择色谱峰信息丰富，提取效率高，总峰面积较大的方法。

综上所述，最终确定的最佳供试品制备方法为：取本品，剪碎，混匀。取1g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，取出，放至室温，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3色谱柱的选择

色谱柱的填料和装填方式可能对药品化学成分分离效果产生影响。发明人对agilentzorbaxsb-c18、phenomenexgemiric18、thermoods-2、inertsilods-3、unitaryc18五个不同品牌的c18色谱柱(5μm，250×4.6mm)进行考察。其他色谱条件同实施例1。agilentzorbaxsb-c18柱的分离效果和峰型均优于其余四种，故优先选择agilentzorbaxsb-c18色谱柱。结果见图8。

2.4柱温的选择

在色谱指纹图谱测定中，柱温往往会影响分离效果，发明人分别在30℃、35℃、40℃三个柱温条件下，对丁桂儿脐贴供试品溶液的指纹图谱进行分析。结果表明在30℃时各个色谱峰的分离效果比较好，故最优选择30℃为检测时柱温。结果见图9。

2.5流速考察

在色谱指纹图谱测定中，流速在一定程度上会影响分离效果，本试验分别在0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min四个流速条件下，对丁桂儿脐贴供试品溶液的指纹图谱进行分析，结果表明在1.0ml/min时各个色谱峰的分离效果比较好，故选择1.0ml/min为最合适的流速。结果见图10。

2.6色谱信息采集时间确定

为考察色谱信息采集时间，对本品进行检测，色谱条件如下：色谱柱为agilentzorbaxsb-c18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；检测波长254nm；柱温30℃；流速1.0ml/min；进样量10μl；流动相：以甲醇为流动相a，0.2％甲酸溶液为流动相b，按下表进行梯度洗脱。采集120min内的色谱信息，所得色谱图见附图11。

由图可知，90min后无色谱峰，故只采集90min内的色谱信息。

实施例3流动相系统比较研究

根据预实验结果，考察不同的流动相体系，筛选色谱峰信息最丰富，分离度最好的色谱条件。

供试品溶液的制备：取本品，剪碎，混匀。取1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(500w，40khz)30分钟，取出，放至室温，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

采用agilentzorbaxsb-c18色谱柱，柱温30℃，检测波长254nm，流速1.0ml/min，考察乙腈-水溶液，甲醇-水溶液，甲醇-0.2％甲酸溶液、甲醇-0.2％磷酸溶液、甲醇-0.2％乙酸溶液5个系统。

(1)系统1：乙腈为流动相a，水溶液为流动相b，采集时间65min。洗脱梯度见下表，所得色谱图参见附图12。

(2)系统2：甲醇为流动相a，水溶液为流动相b，采集时间75min。洗脱梯度见下表，所得色谱图参见附图13。

(3)系统3：甲醇为流动相a，0.2％甲酸溶液为流动相b，采集时间70min。洗脱梯度见下表，所得色谱图参见附图14。

(4)系统4：甲醇为流动相a，0.2％磷酸溶液为流动相b，采集时间70min。洗脱梯度见下表，所得色谱图参见附图15。

(5)系统5：甲醇为流动相a，0.2％乙酸溶液为流动相b，采集时间70min。洗脱梯度见下表，所得色谱图参见附图16。

结果确定甲醇-0.2％甲酸溶液体系(系统3)对丁桂儿脐贴的供试品溶液色谱峰分离效果较好。

实施例4指纹图谱方法学验证

4.1空白试验

取75％甲醇，按实施例1色谱条件直接进样，记录90分钟的色谱图，结果表明体系不存在残留和干扰。

4.2系统适用性试验

取本品(批号151012)，按照实施例1方法操作，制备成供试品溶液，直接进样6次，以6号峰为参照峰，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示12个共有峰的相对保留时间稳定，rsd均小于1％，相对峰面积相对恒定，rsd均小于3％；表明方法的系统适用性良好。结果见表4、表5、图17。

表4系统适用性试验相对保留时间

表5系统适用性试验相对峰面积

3.3重复性试验

试验人员a，取同一批次丁桂儿脐贴(批号151012)，按照实施例1方法操作，制备6份供试品溶液，检测，以6号峰为参照峰，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示12个共有峰的相对保留时间稳定，rsd均小于1％，相对峰面积相对恒定，rsd均小于3％；表明该方法重复性良好。结果见表6、表7、图18。

表6重复性试验相对保留时间

表7重复性试验相对峰面积

3.4中间精密度试验

试验人员b，取同一批次丁桂儿脐贴(批号151012)，按照实施例1方法操作，制备6份供试品溶液，用与实验人员a不同的高效液相色谱仪、不同的色谱柱检测，以6号峰为参照峰，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示12个共有峰的相对保留时间稳定，rsd均小于1％，相对峰面积相对恒定，rsd均小于3％；表明该方法重复性良好。结果见表8、表9、图19。

表8中间精密度试验相对保留时间

表9中间精密度试验相对峰面积

3.5稳定性试验

取本品(批号151012)，按照实施例1方法操作，分别于供试品制备0、2、4、8、12、18、24、32、40、48小时进样检测，以6号峰为参照峰，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示12个共有峰的相对保留时间稳定，rsd均小于1％，相对峰面积相对恒定，rsd均小于3％；表明本品的供试品溶液在48小时内稳定。结果见表10、表11、图20。

表10稳定性试验相对保留时间

表11稳定性试验相对峰面积

3.6耐用性试验

3.6.1不同仪器耐用性

取本品(批号151012)，按照实施例1方法操作，使用不同型号的仪器进行检测，以agilent1260仪器图谱为参照，以参照图谱计算不同仪器之间图谱的相似度，结果表明不同仪器间测定结果大致相同，指纹图谱相似度均大于0.98，说明高效液相色谱仪的型号对本指纹图谱方法影响不大。结果见表12、图21。

表12仪器耐用性试验结果

3.6.2不同批次色谱柱耐用性

取本品(批号151012)，按照实施例1方法操作，使用同一型号不同批次色谱柱进行检测，以其中一个批次色谱柱(序列号uscl060354)图谱为参照，计算相似度，结果表明不同批次色谱柱间测定结果大致相同，指纹图谱相似度均大于0.99，说明色谱柱的批次对本方法影响不大。结果见表13、图22。

表13色谱柱耐用性试验结果

3.7相对保留时间

以6号峰(桂皮醛)为参照峰，计算各共有色谱峰的相对保留时间应在表14所示的范围内。见表14。

表14相对保留时间

实施例5对照指纹图谱建立

对亚宝药业集团股份有限公司生产的批号为151012、151013、151014、151015、151016、151020、151065、151066、151067、151069的丁桂儿脐贴，共计10批次样品，分别按实施例1建立的指纹图谱测定方法进行检测，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.0版本)拟合生成对照指纹图谱，见图23。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。