本发明涉及食品领域。具体地,本发明涉及测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法。
背景技术:
:甜菊糖苷是一种天然的非营养型高甜度甜味剂,它是从原产南美巴拉圭和巴西的菊科多年生灌木植物甜叶菊(steviarebaudianabertoni)的叶子中提取而得到的,其甜度是蔗糖的250~300倍,有后苦和青草味。甜菊糖苷具有高甜度、低热量、无毒等特性,长期食用不会使人发胖,特别适宜肥胖病、糖尿病、高血压、动脉硬化、龋齿病患者使用,而且物理、化学性质稳定、无发酵性,可延长甜菊糖苷制品的保质期。因而,被广泛应用在食品和药物行业中,被誉称为继蔗糖、甜菜糖之后的第三种天然糖源。甜菊糖苷代替蔗糖符合现代人对健康理念的要求,因此开发甜菊糖苷具有极广阔的前景。含乳饮料是指以新鲜牛乳(或乳粉)为主要原料,经发酵或不发酵,加入水与适量辅料(如可可、咖啡、果汁和蔗糖等)加工而成的具有相应风味的饮品。然而,目前含乳饮料中甜菊糖苷含量的检测方法仍有待开发。技术实现要素:本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明提出了测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法,该方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。需要说明的是,本发明是基于发明人的下列发现而完成的:目前甜菊糖苷的检测方法主要是地方标准方法DBSS22/007-2012《食品安全地方标准食品中甜菊糖苷的测定高效液相色谱法》,该前处理方法较为繁琐,不适合基质较复杂的含乳饮料中甜菊糖苷的检测。而国标GB8270-2014《食品安全国家标准食品添加剂甜菊糖苷》只是简单的介绍了水溶性样品的提取及检测方法,相对于基质较复杂的含乳饮料而言不适合。有鉴于此,发明人经过大量实验发现,预先将含乳饮料与乙酸铅溶液混合,以沉淀脂肪、蛋白质等杂质,通过离心除去沉淀,得到的上清液,再利用流动相进一步萃取沉淀中的甜菊糖苷,并将所得到的待测液进行色谱法检测,从而能够准确地测定出含乳饮料中甜菊糖苷含量。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。为此,本发明提出了一种测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:(1)将所述含乳饮料与乙酸铅溶液进行第一混合,并将得到的第一混合液进行第一离心,分离所得到的沉淀和第一上清液;(2)将所述沉淀与流动相进行第二混合,并将所得到的第二混合液进行第二离心,收集第二上清液;(3)合并所述第一上清液和第二上清液,并用所述流动相定容,再将所得到的第三混合液进行过滤,得到待测液;以及(4)利用色谱法对所述待测液进行检测,并基于检测结果确定所述含乳饮料中甜菊糖苷含量。发明人发现,含乳饮料中基质较复杂,若直接进行离心、收集上清液,并对上清液进行检测,则基质干扰较大,导致检测结果不准确,且对仪器造成损害。进而,发明人发现,预先利用有机溶剂将含乳饮料中的大量基质沉淀,对含有甜菊糖苷的上清液进行检测,能够有效地避免基质干扰,从而提高检测结果的准确性、精密度及稳定性。为此,发明人经过大量实验得到最优有机溶剂—乙酸铅,乙酸铅能够充分沉淀蛋白质、脂肪等物质,而甜菊糖苷保留在上清液中,且得到的上清液较澄清,对后续的色谱法检测的干扰较小,从而较大程度地提高了检测结果的准确性。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。根据本发明的实施例,上述测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法还可以具有下列附加技术特征:根据本发明的实施例,所述乙酸铅溶液的浓度为2体积%。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。根据本发明的实施例,基于5g所述含乳饮料,所述乙酸铅溶液的用量为0.5~1mL,优选0.5mL。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。根据本发明的实施例,步骤(2)中,基于5g所述含乳饮料,所述流动相的用量为20mL。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。根据本发明的实施例,所述流动相为磷酸-乙腈溶液,所述磷酸-乙腈溶液中乙腈与磷酸的体积比为3:7。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、操作简便。根据本发明的实施例,所述色谱法检测条件如下:色谱柱:艾杰尔C18色谱柱(250mm×4.6mm,5.0μm);流速:1.0mL/min;0.002mol/L所述流动相;进样量:20μL;柱温:30℃;波长:210nm。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。根据本发明的实施例,所述第一混合和第二混合分别独立地包括进行超声5~10min。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。根据本发明的实施例,所述第一离心和第二离心分别独立地在3000~5000r/min的转速下进行5~10min,优选4000r/min的转速下进行5min。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。另外,本发明提出了另一种测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:1)称取5g所述含乳饮料于50mL离心管中,加入0.5mL2体积%乙酸铅水溶液,超声10min后,4000r/min离心5min,取所得到的第一上清液于50ml容量瓶中,沉淀保留在离心管中;2)加入10ml的流动相(磷酸-乙腈溶液,其中乙腈与磷酸的体积比为3:7)于所述离心管中,超声5min后,4000r/min离心5min,取所得到的第二上清液于所述容量瓶中,沉淀保留在所述离心管中;3)重复步骤2)的操作2次,每次所述流动相的用量为5mL;4)于所述容量瓶中,用所述流动相定容,得到待测液;5)称取甜菊糖苷标准品,配制浓度分别为5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL的甜菊糖苷标准溶液,0.22nm有机膜过滤,得到系列标准溶液;6)利用液相色谱分别对所述待测液及系列标准溶液进行检测,将所得到的系列标准溶液的峰面积与溶液浓度绘制标准曲线,并将所述待测液的峰面积代入所述标准曲线,以便确定所述含乳饮料中甜菊糖苷含量,其中,色谱检测条件如下:色谱柱:艾杰尔C18色谱柱(250mm×4.6mm,5.0μm);流速:1.0mL/min;流动相:0.002mol/L磷酸-乙腈溶液,磷酸-乙腈溶液中乙腈与磷酸的体积比为3:7;进样量:20μL;柱温:30℃;波长:210nm。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。附图说明本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:图1显示了根据本发明一个实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法的流程示意图。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。需要说明的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地,在本发明的描述中,除非另有说明,“多个”的含义是两个或两个以上。本发明提出了一种测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法,下面将对其进行详细描述。根据本发明的实施例,参见图1,方法包括:获得第一上清液S100;获得第二上清液S200;获得待测液S300;以及色谱法检测S400。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。S100获得第一上清液在该步骤中,将含乳饮料与乙酸铅溶液进行第一混合,并将得到的第一混合液进行第一离心,分离所得到的沉淀和第一上清液。发明人发现,含乳饮料中基质较复杂,若直接进行离心、收集上清液,并对上清液进行检测,则基质干扰较大,导致检测结果不准确,且对仪器造成损害。进而,发明人发现,预先利用有机溶剂将含乳饮料中的大量基质沉淀,对含有甜菊糖苷的上清液进行检测,能够有效地避免基质干扰,从而提高检测结果的准确性。为此,发明人经过大量实验得到最优有机溶剂—乙酸铅,乙酸铅能够充分沉淀蛋白质、脂肪等物质,而甜菊糖苷保留在上清液中,且得到的上清液较澄清,对后续的色谱法检测的干扰较小,从而较大程度地提高了检测结果的准确性、精密度及稳定性。然而,其他有机溶剂的沉淀效果较差,例如,将导致蛋白质、脂肪等物质沉淀不完全,上清液较浑浊,影响后续检测;或者将导致大量甜菊糖苷随蛋白质、脂肪等物质一同沉淀,检测结果偏低。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。根据本发明的实施例,乙酸铅溶液的浓度为2体积%。发明人意外地发现,乙酸铅溶液的浓度影响检测结果的准确性。进而,经过大量实验得到最优乙酸铅溶液浓度为2体积%,在此条件下能够充分使蛋白质、脂肪等物质沉淀,上清液较澄清,检测结果的准确性较强。若浓度过低,上清液较浑浊,且与沉淀分界不明显,导致检测结果的准确性较低;若浓度过高,将导致提取的甜菊糖苷浓度较低,后续色谱法检测的峰面积较小,误差较大,并且浪费药品。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。根据本发明的实施例,基于5g含乳饮料,乙酸铅溶液的用量为0.5~1mL,优选0.5mL。发明人经过大量实验得到上述乙酸铅最优用量,在此条件下能够充分使蛋白质、脂肪等物质沉淀,上清液较澄清,检测结果的准确性较强。若用量过高,将导致提取的甜菊糖苷浓度较低,后续色谱法检测的峰面积较小,误差较大;若用量过低,无法充分沉淀脂肪、蛋白质等物质,上清液较浑浊,且与沉淀分界不明显,导致检测结果的准确性较低。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。根据本发明的实施例,第一混合包括在超声下进行5~10min。由此,能够充分沉淀脂肪、蛋白质等物质,防止干扰。根据本发明的另一个实施例,第一离心是在3000~5000r/min的转速下进行5~10min,优选4000r/min的转速下进行5min。由此,能够有效地使沉淀和上清液分离,便于后续提取。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。S200获得第二上清液在该步骤中,将沉淀与流动相进行第二混合,并将所得到的第二混合液进行第二离心,收集第二上清液。根据本发明的实施例,流动相为磷酸-乙腈溶液,磷酸-乙腈溶液中乙腈与磷酸的体积比为3:7。发明人进一步发现,若不含步骤S200,直接将收集的第一上清液进行定容的操作,回收率较低,而且标准品的出峰位置与样品中目标物的出峰位置有所偏移,从而使检测结果的准确性和精密度较低。主要原因可能是,由于含乳饮料中基质较复杂,利用乙酸铅沉淀蛋白质和脂肪时,容易将少量甜菊糖苷带入沉淀中,导致回收率偏低。进而,发明人意外地发现,利用后续色谱法检测过程中的流动相—磷酸-乙腈溶液进一步萃取沉淀中的甜菊糖苷,能够有效地提高检测结果的准确性和精密度。接着,发明人发现,选择乙腈、磷酸作为流动相,且乙腈与磷酸的体积比为3:7时,检测结果的准确性和精密度进一步提高。乙腈能够有效地从沉淀中提取出甜菊糖苷,磷酸盐起到调节流动相pH值的作用,从而影响目标物的出峰时间。若乙腈的比例增大,目标物出峰时间较长,延长检验周期;若乙腈比例较小,目标物则与样品的杂峰相重合,影响检验准确度,且无法充分从沉淀中提取出甜菊糖苷。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。根据本发明的实施例,步骤S200中,基于5g含乳饮料,流动相的用量为15~25mL,优选20mL。发明人经过大量实验得到上述流动相最优用量,在此条件下能够充分提取出蛋白质和脂肪沉淀中的甜菊糖苷,检测结果的准确性较强。若用量过高,将导致提取的甜菊糖苷浓度较低,后续色谱法检测的峰面积较小,误差较大;若用量过低,无法充分从沉淀中提取出甜菊糖苷,导致检测结果偏低。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。根据本发明的实施例,步骤S200中,流动相分两次与S100所得到的沉淀进行第二混合。发明人发现,将流动相以任意比例分为两份,先将其中一份与沉淀进行混合,再将所得到的混合液离心,收集上清液;再向沉淀中加入另一份流动相并混合离心,收集上清液。由此能够充分提取出甜菊糖苷,从而提高了检测结果的准确性。优选,将流动相等分为两份。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。根据本发明的实施例,第二混合包括在超声下进行5~10min。由此,能够充分萃取甜菊糖苷。根据本发明的另一个实施例,第二离心是在3000~5000r/min的转速下进行5~10min,优选4000r/min的转速下进行5min。由此,能够有效地使沉淀和上清液分离,便于后续提取。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。S300获得待测液在该步骤中,合并第一上清液和第二上清液,并用流动相定容,再将所得到的第三混合液进行过滤,得到待测液。发明人意外地发现,若用水进行定容,目标物与标准品的出峰位置不同,有所偏移,延长检测时间,且检测结果的准确性偏低。利用流动相定容后,目标物与标准品的出峰位置一致,且检测结果的准确性较强。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。S400色谱法检测在该步骤中,利用色谱法对待测液进行检测,并基于检测结果确定含乳饮料中甜菊糖苷含量。根据本发明的实施例,色谱法检测条件如下:色谱柱:艾杰尔C18色谱柱(250mm×4.6mm,5.0μm);流速:1.0mL/min;0.002mol/L流动相;进样量:20μL;柱温:30℃;波长:210nm。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、稳定性好、操作简便。另外,本发明提出了另一种测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法。根据本发明的实施例,方法包括:1)称取5g含乳饮料于50mL离心管中,加入0.5mL2体积%乙酸铅水溶液,超声10min后,4000r/min离心5min,取所得到的第一上清液于50ml容量瓶中,沉淀保留在离心管中;2)加入10ml的流动相(磷酸-乙腈溶液,其中乙腈与磷酸的体积比为3:7)于离心管中,超声5min后,4000r/min离心5min,取所得到的第二上清液于容量瓶中,沉淀保留在离心管中;3)重复步骤2)的操作2次,每次流动相的用量为5mL;4)于容量瓶中,用流动相定容,得到待测液;5)称取甜菊糖苷标准品,配制浓度分别为5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL的甜菊糖苷标准溶液,0.22nm有机膜过滤,得到系列标准溶液;6)利用液相色谱分别对待测液及系列标准溶液进行检测,将所得到的系列标准溶液的峰面积与溶液浓度绘制标准曲线,并将待测液的峰面积代入标准曲线,以便确定含乳饮料中甜菊糖苷含量,其中,色谱检测条件如下:色谱柱:艾杰尔C18色谱柱(250mm×4.6mm,5.0μm);流速:1.0mL/min;流动相:0.002mol/L磷酸-乙腈溶液,磷酸-乙腈溶液中乙腈与磷酸的体积比为3:7;进样量:20μL;柱温:30℃;波长:210nm。由此,根据本发明实施例的测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法准确性强、精密度高、操作简便。在本发明的上下文中,所有在此公开了的数字均为近似值。每一个数字的数值有可能会出现1%、2%、5%、7%、8%或10%等差异。每当公开一个具有N值的数字时,任何具有N+/-1%,N+/-2%,N+/-3%,N+/-5%,N+/-7%,N+/-8%或N+/-10%值以内的数字会被明确地公开,其中“+/-”是指加或减。每当公开一个数值范围中的一个下限,DL,和一个上限,DU,时,任何处于该公开了的范围之内的数值会被明确地公开。下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。仪器和设备:天平:感量为0.1mg,厂家:METTLERTOLEDO,型号:XP205液相色谱仪:带紫外检测器,厂家:戴安,型号:U-3000离心机:厂家:HealForce,型号:Neofuge23R超声波清洗机:厂家:旗美,型号:QC10260实施例1在该实施例中,按照下列方法测定含乳饮料中甜菊糖苷含量的方法:1、试剂超纯水;0.002mol/L磷酸溶液:精密称取0.196g磷酸于1000mL容量瓶中,加水定容至刻度;2%乙酸铅溶液:准确称取20g乙酸铅于1L容量瓶中,用水溶解并定容至刻度,混匀后备用;乙腈:色谱纯。2、测定步骤(1)待测液的制备(1-1)称取试样约5g(精确到0.1mg)于50mL离心管中,加入0.5mL2%乙酸铅水溶液,超声10min后,4000r/min离心5min,取上清液于50ml容量瓶中,沉淀保留在离心管中;(1-2)加入10ml的流动相(磷酸-乙腈溶液,其中乙腈与磷酸的体积比为3:7)于50ml离心管中,超声5min后,4000r/min离心5min,取上清液于上述50ml容量瓶中,沉淀保留在离心管中;(1-3)重复步骤(1-2)操作2次,每次流动相的用量为5mL;(1-4)于50mL容量瓶中,用流动相定容至刻度,得到待测液。(2)制备甜菊糖苷标准溶液:甜菊糖苷储备液:精密称取甜菊糖苷标准品10mg于10mL容量瓶中,加1ml乙腈,溶解后加水定容至刻度,得甜菊糖苷浓度为1mg/mL的甜菊糖苷储备液。甜菊糖苷系列标准溶液的制备:精密吸取甜菊糖苷储备液0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL于10mL容量瓶中,用流动相稀释并定容至刻度,得浓度为5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL的甜菊糖苷的系列标准溶液。取此系列标准溶液适量,过0.22nm有机膜,得到系列标准溶液。(3)利用液相色谱分别对步骤(1)的待测液及步骤(2)所得到的系列标准溶液进行检测,将所得到的系列标准溶液的峰面积与溶液浓度绘制标准曲线,并将待测液的峰面积代入标准曲线,从而计算得到含乳饮料中甜菊糖苷含量。其中,色谱检测条件如下:色谱柱:艾杰尔C18色谱柱(250mm×4.6mm,5.0μm);流速:1.0mL/min;流动相:0.002mol/L磷酸-乙腈溶液,磷酸-乙腈溶液中乙腈与磷酸的体积比为3:7;进样量:20μL;柱温:30℃;波长:210nm。实施例2准确度和精密度测定在该实施例中,按照下列方法测定回收率:(1)将不含甜菊糖苷的含乳饮料与甜菊糖苷标准品溶液混合,得到加标样品;(2)按照实施例1的方法测定加标样品中甜菊糖苷含量,并基于下列公式计算回收率:回收率(%)=加标样品中甜菊糖苷含量的测定值×100/加标样品中甜菊糖苷含量的理论值。结果如表1所示,其中,加标样品中甜菊糖苷含量的理论值如表1所示的“加标量”。可以看出,回收率在90%~100%的范围内,RSD值在1.34%~1.68%的范围内,说明本发明方法的精密度和准确度较高。表1本发明的精密度和准确度(n=6)试验序号加标量(mg/kg)检测结果(mg/kg)回收率范围(%)RSD(%)14.03.8392.12~96.421.3428.07.6893.59~96.871.52320.019.193.35~97.571.68对比例1在该对比例中,按照实施例1的方法进行检测,区别在于,乙酸铅溶液浓度为1%。结果如表2所示。可以看出,加入2%乙酸铅溶液的准确度、精密度以及稳定性都比1%的乙酸铅溶液的效果好。表2实施例1和对比例1的检测结果对比例2在该对比例中,按照实施例1的方法进行检测,区别在于,不含步骤(1-2)和(1-3),直接将上清液进行定容。结果如表3所示。可以看出,利用流动相提取比不用流动相提取的准确度、精密度以及稳定性较高。表3实施例1和对比例2的检测结果对比例3在该对比例中,按照实施例1的方法进行检测,区别在于,利用水进行定容。用水直接定容提取液,目标物的出峰时间与标准品的出峰时间有部分偏离,且参见表4,对比文件3的准确度较差。表4实施例1和对比例3的检测结果对比例4在该对比例中,按照实施例1的方法进行检测,区别在于,以5mL乙腈替代乙酸铅。结果如表5所示。可以看出,采用乙腈沉淀蛋白质和脂肪,回收率和精密度较低。表5对比例4的检测结果在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页1 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