标志物及其应用、试剂盒、该标志物的检测方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及标志物及其应用、试剂盒、该标志物的检测方法。
背景技术：
：类风湿关节炎(RheumatoidArthritis，RA)是一种主要以关节滑膜炎症反应为病理改变的慢性自身免疫性疾病。RA的病变过程与患者体内产生多种自身抗体并与相应抗原形成抗原抗体免疫复合物(ICs)密切相关，部分循环中的ICs可反复沉积于关节滑膜组织，通过激活补体系统级联反应引起滑膜炎症，造成关节损伤。RA患者关节液和血清中的ICs可促进软骨细胞的生长、NO的生成和细胞凋亡，提示ICs在RA发病中扮演着重要的作用。ICs在RA检测中具有较高的敏感性，ICs持续增高常提示RA患者预后较差。只有含有IgG和IgM类抗体的复合物才能活化补体的经典途径而引起炎症。这两类抗体在血清中含量较大，是构成免疫复合物的主要抗体；可溶性抗原与相应抗体形成的较大免疫复合物活化补体的能力较强。IgG抗体为双价，可与相应的多价抗原交互结合形成较大的免疫复合物；IgM分子可形成更大的免疫复合物。抗原－抗体亲和力高时易形成大而稳定的免疫复合物。RA患者关节液和血清中存在较高水平的瓜氨酸肽与ACPA形成的免疫复合物，正常情况下，抗原抗体复合物在机体中被吞噬清除，然而在病例状态下，ICs可诱发炎症反应。RA发病过程中伴随多种免疫活性细胞如T细胞、B细胞、巨噬细胞、滑膜成纤维细胞(Fibroblast-likesynovicyte,FLS)和中性粒细胞等的活化及细胞因子(IL6、TNF-α)、趋化因子和炎性介质的释放。RAFLS增殖与局部关节炎症和血管翳形成、骨破坏密切相关，FLS增殖和细胞因子分泌异常在RA发病过程中发挥关键作用。RA血清中存在含有瓜氨酸化蛋白与ACPA的ICs具有促FLS增殖能力，并可刺激FLS分泌更多细胞因子，参与RA发病机制。自身免疫性是类风湿关节炎的主要特征,最佳例证是血浆中可检测出高滴度的自身抗体,其中研究最为透彻的是类风湿因子(rheumatoidfactors，RF)，但RF不只在RA中出现,也可见于正常人,并在其他一些疾病中升高。近年来，抗瓜氨酸化蛋白抗体(anti-citrullinatedproteinantibodies，ACPA)虽然在RA常规诊断中尚未完全取代RF的地位，但其已成为诊断RA的首选指标。总体而言，ACPA与RF敏感性相近，但特异性更高。这些抗体识别转录后被瓜氨酸化的多种蛋白，包括聚丝蛋白(filaggrin)、波形蛋白(vimentin)、α和β纤维蛋白(α-andβ-fibrin)、α-烯醇化酶(α-enolase)及I型和Ⅱ型胶原多肽(TypeIandtypeⅡcollagen)。ACPA的检测是通过ELISA法检测血清对环瓜氨酸多肽(CCP)的反应。最初的临床检验以检测抗瓜氨酸化聚丝蛋白的环状多肽的反应为基础，因为环瓜氨酸多肽与天然构象表位更为接近，从而提高的实验结果的准确性。目前这一实验已被结果更准确的第二代试验——抗CCP2Elisa——所取代，它使用从瓜氨酸化多肽库中筛选的瓜氨酸化多肽，这些瓜氨酸化的多肽均为人工合成。近期研究显示瓜氨酸化残基可在肺和滑膜表达，ACPA的产生可能为肽基精氨酸脱亚胺酶(Peptidylargininedeiminase，PAD)介导的蛋白在肺及滑膜脱亚氨基作用而致。这些蛋白可被特异性抗原递呈细胞或通过B细胞形成的免疫复合物所摄取，并递呈给T细胞，促进激活ACPA反应性B细胞。目前关于RF的检测特异性较低；采用人工合成瓜氨酸化多肽用于ACPA的检测，仅可以反映自生抗体的水平，且ACPA水平未必与疾病状态相关联。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供标志物及其应用、试剂盒、该标志物的检测方法。本发明的目的是利用内源瓜氨酸化抗原与ACPA可以形成抗原抗体免疫复合物的原理，寻找和摸索一种瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物的检测方法及相关ELISA试剂盒，不仅可以反映ACPA的水平，还可以反映瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物的水平，并且瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物与疾病状态相关联，其量的变化可以直接反映病情的进展情况和治疗的效果评价，以实现快速、准确、方便诊断和评价RA的目的。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种标志物(ECP)，其为内源瓜氨酸化抗原与抗瓜氨酸化抗体的免疫复合物。利用内源RA特异性瓜氨酸化蛋白抗原检测ACPA，其结果不仅可以反映患者血清中ACPA的水平，还可以进一步反映患者内源瓜氨酸化抗原与ACPA抗原抗体复合物的水平或免疫复合物反应的能力，循环中的ECP可反复沉积于关节滑膜组织引起滑膜炎症，造成关节损伤。因此，ECP不仅可作为RA诊断和判断预后的生物学标志，并且可在疾病进展中发挥作用，对于目前的理论研究和临床实践将具有重要的意义。RA患者血清中具有天然构象表位的瓜氨酸化蛋白更易于与ACPA形成抗原抗体免疫复合物，目前尚未有关利用内源瓜氨酸化蛋白抗原检测ACPA的方法。本发明利用内源瓜氨酸化抗原与ACPA可以形成抗原抗体免疫复合物的原理，寻找和摸索一种瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物的检测方法及相关ELISA试剂盒，不仅可以反映ACPA的水平，还可以反映瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物的水平，并且瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物与疾病状态相关联，其量的变化可以直接反映病情的进展情况和治疗的效果评价，以实现快速、准确、方便诊断和评价RA的目的。在本发明的一些具体实施方案中，所述标志物中所述内源瓜氨酸化抗原为一类内源瓜氨酸化蛋白质。在本发明的一些具体实施方案中，所述标志物中所述抗瓜氨酸化抗体为IgG和/或IgM类抗体。本发明还提供了所述标志物相应的所述抗瓜氨酸化抗体在制备类风湿关节炎的诊断试剂或诊断工具中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的所述应用中所述诊断工具为诊断试剂盒。本发明还提供了一种试剂盒，包括抗瓜氨酸化抗体和检测中可接受的试剂；所述抗瓜氨酸化抗体与待测样品中内源瓜氨酸化抗原形成所述标志物。在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的所述试剂盒中所述试剂还包括载体、封闭液、洗涤液、样品稀释液、标记抗体、底物、显色液、终止液中的一种或两者以上的混合物。本发明涉及的瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物的检测方法及相关ELISA试剂盒，包括抗瓜氨酸化抗体预包被的载体、标记好的抗人IgG/IgM抗体以及相关的样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液。在本发明的一些具体实施方案中，上述抗瓜氨酸化抗体是指采用PAD催化牛血清白蛋白(BSA)形成的具有多种瓜氨酸化位点的BSA(cit-BSA)作为抗原免疫动物产生的抗瓜氨酸化抗体。具体位点为BSA蛋白的所有可以被瓜氨酸化的精氨酸位点；所述抗体可由市场购买得到。在本发明的一些具体实施方案中，上述cit-BSA可以用其它蛋白，尤其是人关节滑膜特有蛋白经PAD等酶催化形成瓜氨酸化蛋白抗原免疫动物获得抗人瓜氨酸化抗体。具体有PAD4/PAD2两种酶，可以将蛋白质上的精氨酸位点催化形成瓜氨酸。在本发明的一些具体实施方案中，上述抗瓜氨酸化抗体预包被的载体是指将抗瓜氨酸化抗体以包被缓冲液稀释至0.5-100ug/ml，常规包被的酶标板。在本发明的一些具体实施方案中，上述标记好的抗人IgG抗体是指以常规方法经酶标记、化学发光物质标记、荧光素标记或金标记的抗人IgG，其种属来源要求与制备瓜氨酸化抗体的种属来源一致。本发明还提供了所述试剂盒在检测类风湿性关节炎中的应用。本发明还提供了所述标志物的检测方法，包括如下步骤：步骤1：取载体包被所述抗瓜氨酸化抗体，与待测样品混合，孵育，获得包含有样品待测液的载体；步骤2：取载体包被所述抗瓜氨酸化抗体，与阴性参考样品混合，孵育，获得包含有阴性参考样品待测液的载体；步骤3：分别取步骤1制得的包含有样品待测液的载体与步骤2制得的包含有阴性参考样品待测液的载体，洗涤后，分别与标记二抗混合，孵育，洗涤，显色，检测所述待测样品的光吸收值和所述阴性参考样品的光吸收值，获得所述标志物的浓度。在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的所述检测方法步骤3中所述获得所述标志物的浓度＝所述待测样品的光吸收值/所述阴性参考样品的光吸收值。本发明还提供了一种类风湿性关节炎的检测方法，根据所述标志物的浓度获得检测结果。在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的所述检测方法，检测结果为半定量检测结果，用S/N值来表示。所述标志物检测结果S/N大于3.2为阳性；所述标志物检测结果S/N小于等于3.2为阴性。本发明利用内源瓜氨酸化抗原与ACPA可以形成抗原抗体免疫复合物的原理，寻找和摸索一种瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物的检测方法及相关ELISA试剂盒，不仅可以反映ACPA的水平，还可以反映瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物的水平，并且瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物与疾病状态相关联，其量的变化可以直接反映病情的进展情况和治疗的效果评价，以实现快速、准确、方便诊断和评价RA的目的。与现有技术相比，本发明提供一种瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物(ECP)检测方法，其优点可以归纳如下：1.与类风湿因子检测相比，本发明具有更高的特异性(90％以上)，且具有较高的灵敏度。2.与ACPA检测相比，本发明的方法不用人工合成的瓜氨酸化多肽，避免了由于人工合成瓜氨酸肽种类的差异造成各ACPA检测方法之间的差异。3.本发明利用内源瓜氨酸化蛋白与ACPA形成免疫复合物，从而不仅可以检测到ACPA，而且可以检测到瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物。4.本发明仅用常规ELISA方法即可检测瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物，方法简单，耗时短。5.循环中的ECP可反复沉积于关节滑膜组织，通过激活补体系统级联反应引起滑膜炎症，造成关节损伤。6.RA患者体内瓜氨酸化抗原抗体形成免疫复合物的能力与水平对于RA诊断，病情评估及发病机制研究具有重要的指导作用和意义。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示本发明检测原理；其中图1(A)示内源瓜氨酸化蛋白与ACPA形成瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物(ECP)示意图；图1(B)示ECPElisa检测原理示意图；图2示不同稀释倍数下样品血清ECP检测水平；图3示正常人与RA患者ECP水平比较。具体实施方式本发明公开了标志物及其应用、试剂盒、该标志物的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明技术方法的原理是：以抗人瓜氨酸化抗体作为一抗包被，加样孵育时样品中存在的瓜氨酸化蛋白与ACPA形成免疫复合物(ECP)，ECP免疫复合物中的瓜氨酸化蛋白与包被的一抗结合，经洗涤除去未结合蛋白，加入标记抗人IgG/IgM抗体作为二抗，标记二抗与ECP免疫复合物中的ACPA结合，经洗涤除去未结合的标记二抗，加入二抗标记相对应的底物进行反应，使用相关仪器检测反应结果，结果高低反映了样品中ECP的含量水平(见图1)。本发明涉及的瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物的检测方法及相关ELISA试剂盒，包括抗瓜氨酸化抗体预包被的载体、标记好的抗人IgG/IgM抗体以及相关的样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液。其中，上述抗瓜氨酸化抗体是指采用PAD催化牛血清白蛋白(BSA)形成的具有多种瓜氨酸化位点的BSA(cit-BSA)作为抗原免疫动物产生的抗瓜氨酸化抗体。具体位点为BSA蛋白的所有可以被瓜氨酸化的精氨酸位点；所述抗体可由市场购买得到。其中，上述cit-BSA可以用其它蛋白，尤其是人关节滑膜特有蛋白经PAD等酶催化形成瓜氨酸化蛋白抗原免疫动物获得抗人瓜氨酸化抗体。具体有PAD4/PAD2两种酶，可以将蛋白质上的精氨酸位点催化形成瓜氨酸。其中，上述抗瓜氨酸化抗体预包被的载体是指将抗瓜氨酸化抗体以包被缓冲液稀释至0.5-100ug/ml，常规包被的酶标板。其中，上述标记好的抗人IgG抗体是指以常规方法经酶标记、化学发光物质标记、荧光素标记或金标记的抗人IgG，其种属来源要求与制备瓜氨酸化抗体的种属来源一致。具体技术方案如下：1)抗体制备采用PAD催化牛血清白蛋白(BSA)形成的具有多种瓜氨酸化位点的BSA(cit-BSA)，取健康免疫动物，用cit-BSA作为抗原进行免疫，第一次以抗原加卡介苗和弗氏佐剂研匀，注射动物劲淋巴结或皮下肌肉组织，每二周1次，共免疫4-5次，抗原量根据动物体重增减,免疫最后一次的二周后采血，动物抗血清用饱和硫酸铵二级沉淀后上离子交换层析柱,得到动物抗人瓜氨酸化抗体，测定效价，冷冻备用。所用抗体由市场购买，也可以按照此制备方法制备获得。2)抗体标记动物抗人IgG/IgM抗体采用常规方法经酶标记、化学发光物质标记或荧光素标记。3)包被抗体聚苯乙烯微孔板制备取抗人瓜氨酸化抗体，用0.01M，pH7.4PBS缓冲液稀释到0.5-100ug/ml，每孔加量100微升加入到聚苯乙烯微孔板底部，并于2-8℃条件孵育8-48小时；取出用0.01-0.5％TritonX-100洗涤4次，然后加入0.5-5％脱脂奶粉室温封闭0.5-3小时，倒掉封闭液，37℃烘干0.5-3小时，用铝箔袋密封包装。其中，聚苯乙烯微孔板可采用磁珠或其它具有抗体吸附能力的介质代替。4)其他应用试剂：(1)包被缓冲液：PBS缓冲液(0.01M,PH7.4)；(2)封闭液：BSA、脱脂奶粉、酪蛋白(浓度在0.1％到5％范围)；(3)稀释液：BSA、脱脂奶粉、酪蛋白(浓度在0.1％到5％范围)；(4)洗涤液：Tween20、TritonX-100(浓度在0.05％到1％范围)；(5)显色液：TMB(6)终止液：硫酸(7)其它：用于酶标记、化学发光物质标记或荧光素标记相对应的底物及相关试剂。5)ECP诊断试剂盒的具体操作方法：A.用0.5-5％脱脂奶粉稀释样品血清或血浆5-100倍，滴加100ul的上述样品于ELISA反应板的样品孔中；选取其余孔加入阴性参考品和阳性参考品；B.将反应板置于室温孵育0.5-3小时，使血清或血浆中瓜氨酸化蛋白与反应板板上的抗体交联，同时存在于血清或血浆中的ACPA与瓜氨酸化蛋白交联形成抗原抗体免疫复合物；C.用0.01-0.5％TritonX-100洗涤液洗板4次，每次洗板0.5-5min，洗去未交联蛋白；D.用5％脱脂奶粉稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG抗体1:500-1:20000倍，滴加100ul抗体于反应板样品孔中，将平板置于室温孵育0.5-3h，使抗人IgG抗体与反应板上已吸附的ACPA结合；E.用0.01-0.5％TritonX-100洗涤液洗板4次，每次洗板0.5-5min，洗去未交联抗人IgG抗体；F.滴加100ul含显色剂TMB的显色液，室温下显色反应30min；G.滴加100ul1M硫酸的终止液终止反应；H.用酶标仪或分光光度计在400-500nm波长范围内选取最适吸光度下检测光吸收值，同时以600-650nm任取一波长同时测定作为背景参考，以待测样品吸光度与阴性参考品吸光度的比值代表样品中ECP的浓度水平。其中，上述抗人IgG/IgM抗体可以为酶标记、化学发光物质标记或荧光素标记；其中，上述所用底物对应于各自相对应的酶标记、化学发光物质标记或荧光素标记。(1)瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物(ECP)可以作为类风湿关节炎(RA)体外诊断的一种生物标志物。(2)针对(1)中的生物标志物——ECP，发明了一种检测此生物标志物的Elisa方法。该方法可同时检测含IgG和IgM类抗体的瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物，也可以分别检测含IgG类抗体的ECP和含IgM类抗体的ECP。(3)用于检测ECP的Elisa试剂盒包括了包被酶标板、封闭液、洗涤液、样品稀释液，酶标抗体、底物、终止液。(4)(3)中所述包被酶标板是指用抗瓜氨酸化抗体包被，经洗涤，封闭，干燥，封装而制成的酶标板。(5)(4)中所述的瓜氨酸化抗体是指用体外催化形成的瓜氨酸化蛋白作为抗原免疫动物产生的抗瓜氨酸化抗体。(6)(4)中所述抗瓜氨酸化抗体包被浓度为0.5-100ug/ml；包被体积为50-200ul，所用包被缓冲液为常规PBS或碳酸盐缓冲液；包被条件为2-8℃下包被8-48小时或37℃条件下包被1-8小时；(7)(4)中所述洗涤液为0.01-0.5％TritonX-100或0.01-0.5％Tween20，采用常规PBS缓冲液配制，采用手工或机器洗板。(8)(4)中所述样品稀释液为0.1％-5％BSA、脱脂奶粉或酪蛋白，采用常规PBS缓冲液配制。(9)(4)中所述酶标板为聚苯乙烯材质，聚氯乙烯材质，或可用磁珠或其它可与抗体稳定结合的材质制成。(10)(3)中所述封闭液为0.1％-5％BSA、脱脂奶粉或酪蛋白，采用常规PBS缓冲液配制。(11)(3)中所述酶标抗体为抗人IgG/IgM抗体，采用酶标记、化学发光物质标记或荧光素标记。(12)(3)中所述底物与酶标抗体所采用的标记相对应使用。(13)ECP检测特异性高，在90％以上,且具有较高的灵敏度；(14)ECP检测即可以反映ACPA的水平，又可以反映抗原抗体形成复合物的能力和水平。(15)循环中的ECP可反复沉积于关节滑膜组织，通过激活补体系统级联反应引起滑膜炎症，造成关节损伤。ECP与疾病状态相关联，其量的变化可以直接反映病情的进展情况和治疗的效果评价。本发明提供的标志物及其应用、试剂盒、该标志物的检测方法中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1测定一例RA病人血清不同稀释度下的瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物(ECP)水平1)血清制备采用不添加任何抗凝剂的采血管收集RA患者的新鲜血液，用离心机在3000转离心10min，收集上清液即为血清，置于-20℃～-80℃保存备用。2)ECPElisa检测试剂盒准备包被酶标板；样品稀释液(5％脱脂奶粉)；洗涤液(0.5％TritonX-100)；酶标抗体；显色液(TMB)；终止液(1M硫酸)。3)实验操作步骤A.将血清样品用样品稀释液稀释10倍、20倍、50倍、100倍；分别加入反应板的样品孔中，每孔加入体积为100ul；B.室温(25℃)孵育1小时；C.每孔加入洗涤液200ul，洗板4次，每次洗板2min；D.将酶标抗体用样品稀释液按1:10000稀释，每孔加入稀释酶标抗体100ul；E.室温(25℃)孵育1小时；F.每孔加入洗涤液200ul，洗板4次，每次洗板2min；G.每孔加入显色液100ul；室温(25℃)显色反应30min；H.每孔加入终止液100ul；I.用酶标仪450nm下检测各孔的光吸收值(结果见图2及表1)。表1血清不同稀释度下的瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物(ECP)水平稀释倍数OD10倍1.07820倍0.61950倍0.490100倍0.300结果表明样品稀释倍数对检测结果的影响，稀释倍数与OD值呈线性关系。本发明可同时检测含IgG和IgM类抗体的瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物，也可以分别检测含IgG类抗体的ECP和含IgM类抗体的ECP，按照上述检测方法，检测不同的抗体的ECP，结果见表2。表2采用不同三抗用于检测含不同抗体的ECP采用的三抗检测含不同抗体的ECP检测结果(S/N)标记的抗人IgG抗体含IgG类抗体的ECP16.89标记的抗人IgM抗体含IgM类抗体的ECP14.84标记的抗人IgG和IgM抗体含IgG和IgM类抗体的ECP24.77结果表明分别加标记的抗人IgG抗体或标记的抗人IgM抗体，或同时加标记的抗人IgG和IgM抗体都可以检测出阳性结果(S/N>3.2为阳性)，因此本发明可同时检测含IgG和IgM类抗体的瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物，也可以分别检测含IgG类抗体的ECP和含IgM类抗体的ECP。实施例2比较35个正常人和45例RA病人血清中瓜氨酸化抗原抗体免疫复合物(ECP)水平1)血清制备采用不添加任何抗凝剂的采血管收集正常人和RA患者的新鲜血液，用离心机在3000转离心10min，收集上清液即为血清，置于-20℃～-80℃保存备用。2)ECPElisa检测试剂盒准备包被酶标板；样品稀释液(5％脱脂奶粉)；洗涤液(0.5％TritonX-100)；酶标抗体；显色液(TMB)；终止液(1M硫酸)。3)实验操作步骤A.将血清样品用样品稀释液稀释10倍；分别加入反应板的样品孔中，每孔加入体积为100ul；选取其余孔加入阴性参考样品和阳性参考样品各100ulB.室温(25℃)孵育1小时；C.每孔加入洗涤液200ul，洗板4次，每次洗板2min；D.将酶标抗体用样品稀释液按1:10000稀释，每孔加入稀释酶标抗体100ul；E.室温(25℃)孵育1小时；F.每孔加入洗涤液200ul，洗板4次，每次洗板2min；G.每孔加入显色液100ul；室温(25℃)显色反应30min；H.每孔加入终止液100ul；I.用酶标仪450nm和630nm下检测各孔的光吸收值，以A450-A630的差值表示样品的光吸收值；J.结果计算：吸光度比值＝待测样品孔的光吸收值/阴性参考样品孔的光吸收值结果见表3、表4及图3。表3为35例正常样品检测吸光度比值；表4为45例RA病人血清检测吸光度比值表3正常样品检测吸光度比值表4RA病人血清检测吸光度比值由表3、4可知：1、本发明的可行性：正常人血清中ECP水平平均值较低；RA患者血清中ECP水平平均值显著升高(P＜0.05)，为正常人3倍。2、灵敏度和特异性：特异性为92.5％时，灵敏度为66.7％。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3