氧化石墨烯铂纳米复合材料为探针的谷胱甘肽检测试剂盒的制作方法

本发明涉及以氧化石墨烯铂纳米复合材料为探针的谷胱甘肽检测试剂盒，属于分析化学及纳米技术领域。

背景技术：

谷胱甘肽（ʟ-γ-谷氨酰-ʟ-半胱氨酰甘氨酸，gsh）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽。它是哺乳动物组织中最丰富的非蛋白质巯基生物分子，并参与多种生理过程，如代谢和抗氧化防御。细胞内gsh浓度范围在1至10mmol/l。在正常生理情况下，谷胱甘肽还原酶可以维持谷胱甘肽的量比它的氧化形式的量高200～800倍。然而，当细胞受到的氧化压力增加时，更多的谷胱甘肽转化为其氧化态，导致细胞内gsh水平下降，引起许多疾病的发生和发展。相反，gsh升高通常出现于各种癌细胞，可产生氧化应激抵抗效应。由于gsh广泛参与各种生物学功能，因此建立有效的方法在生理条件下检测gsh具有重要的意义。

催化活性纳米材料因其性能稳定、催化活性可调、催化效率高、成本低廉等优点，可作为天然酶的有效替代品，并广泛应用于生物医学和环境化学等。其中，基于组件特性组合的协同增强性能的复合纳米材料更是受到了广泛的关注。

本发明以氧化石墨烯铂纳米复合材料作为仿生催化探针，基于氧化石墨烯铂纳米复合材料良好的模拟过氧化物酶活性，结合谷胱甘肽对氧化石墨烯铂纳米复合材料催化体系的作用，用于谷胱甘肽的检测，提供了一种简便、灵敏的谷胱甘肽检测试剂盒。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种以氧化石墨烯铂纳米复合材料作为仿生催化探针的谷胱甘肽检测试剂盒。试剂盒中包括提供氧化石墨烯铂纳米复合材料溶液（a液），3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐过氧化氢溶液（b液）和谷胱甘肽溶液（标准贮备液）。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的一种基于氧化石墨烯铂纳米复合材料作为仿生催化探针的谷胱甘肽检测试剂盒，其特征是试剂盒中有氧化石墨烯铂纳米复合材料溶液，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐过氧化氢溶液和谷胱甘肽溶液，所述的氧化石墨烯铂纳米复合材料溶液作为a液，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐过氧化氢溶液作为b液，谷胱甘肽溶液为标准贮备液；所述的氧化石墨烯铂纳米复合材料由以下方法制备：往9.225ml浓度为2mg/ml的氧化石墨烯溶液中加入0.575ml浓度为10mg/ml的氯铂酸水溶液，混匀剧烈搅拌15min后，逐滴加入0.2ml浓度为5mg/ml的硼氢化钠水溶液，磁力搅拌4小时后即得，将得到的反应产物冷冻干燥得到氧化石墨烯铂纳米复合材料。

所述的基于氧化石墨烯铂纳米复合材料作为仿生催化探针的谷胱甘肽检测试剂盒，其特征是a液为用双蒸水配制，浓度为11.5mg/l的氧化石墨烯铂纳米复合材料溶液；b液为用10mmol/l，ph=5磷酸盐缓冲溶液配制的含浓度为26.7mmol/l的过氧化氢和浓度为0.13mmol/l3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液；标准贮备液为浓度为0.4mmol/l的谷胱甘肽溶液。

所述的基于氧化石墨烯铂纳米复合材料作为仿生催化探针的谷胱甘肽检测试剂盒，其特征是吸光度测定波长为652nm。

所述的基于氧化石墨烯铂纳米复合材料作为仿生催化探针的谷胱甘肽检测试剂盒，其特征是谷胱甘肽测定的线性范围为0.02~20μmol/l，检测限为4nmol/l。

本发明所述的一种基于氧化石墨烯铂纳米复合材料作为仿生催化探针的谷胱甘肽检测试剂盒测定谷胱甘肽的方法，其特征是将谷胱甘肽标准贮备液用双蒸水稀释为0.004、0.04、0.1、0.2、0.3、0.4mmol/l的系列标准溶液，在200μl双蒸水和上述系列标准溶液中分别加入50μla液和3.75mlb液，充分混匀后置于30°c水浴反应5分钟，测定652nm波长处的吸光度值，双蒸水对照组的吸光度为a0，谷胱甘肽测定组的吸光度为a，以a0/a对谷胱甘肽浓度作图绘制谷胱甘肽标准曲线或计算回归方程。

所述的基于氧化石墨烯铂纳米复合材料作为仿生催化探针的谷胱甘肽检测试剂盒测定谷胱甘肽的方法，其特征是a液为用双蒸水配制，浓度为11.5mg/l的氧化石墨烯铂纳米复合材料溶液；b液为用10mmol/l，ph=5磷酸盐缓冲溶液配制的含浓度为26.7mmol/l的过氧化氢和浓度为0.13mmol/l3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液。

所述的一种基于氧化石墨烯铂纳米复合材料作为仿生催化探针的谷胱甘肽检测试剂盒测定谷胱甘肽的方法，其特征是测定谷胱甘肽的线性范围为0.02~20μmol/l，检测限为4nmol/l。

本发明所述的一种基于氧化石墨烯铂纳米复合材料作为仿生催化探针的谷胱甘肽检测试剂盒测定溶血样品中谷胱甘肽的方法，其特征是将谷胱甘肽标准贮备液用双蒸水稀释为0.004、0.04、0.1、0.2、0.3、0.4mmol/l的系列标准溶液，在200μl双蒸水和上述系列标准溶液中加入50μla液和3.75mlb液，充分混匀后置于30°c水浴反应5分钟，测定652nm波长处的吸光度值，双蒸水对照组的吸光度为a0，谷胱甘肽测定组的吸光度为a，以a0/a对谷胱甘肽浓度作图绘制谷胱甘肽标准曲线或计算回归方程；取人溶血样品，13000rpm，4^oc超滤25分钟，滤液用双蒸水稀释5倍，在200μl人溶血样品稀释液中加入50μla液和3.75mlb液，充分混匀后置于30°c水浴反应5分钟，测定652nm波长处的吸光度值，根据谷胱甘肽标准曲线进行定量，获得溶血样品中的谷胱甘肽含量。

所述的基于氧化石墨烯铂纳米复合材料作为仿生催化探针的谷胱甘肽检测试剂盒测定溶血样品中谷胱甘肽的方法，其特征是a液为用双蒸水配制，浓度为11.5mg/l的氧化石墨烯铂纳米复合材料溶液；b液为用10mmol/l，ph=5磷酸盐缓冲溶液配制的含浓度为26.7mmol/l的过氧化氢和浓度为0.13mmol/l3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液。

具体地说，本发明采用以下技术方案：

（一）氧化石墨烯的制备：称取325目鳞片石墨，加入到体积比为9:1的浓硫酸和磷酸混合溶液中。充分搅拌后，置于在0℃冰浴中。将高锰酸钾少量多次，缓慢加入到以上混合溶液中进行低温插层反应。磁力搅拌3小时后，将所得的墨绿色混悬液转移至35℃温水浴进行中温反应，控温反应1小时。再将得到的混悬液转移至50℃温水浴进行高温深度氧化，控温12小时。得到的紫黑色混悬液缓慢加入到冰水混合物中，剧烈搅拌1小时。继而往溶液中逐滴滴加30%过氧化氢溶液，至溶液颜色突变为亮黄色。所得溶液经g1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤，继而4000转每分钟离心30分钟，分别经过水洗一次和酸洗一次后，醇洗至中性，最后用乙醚冲洗后经g5砂芯漏斗（孔径1.5-2.5微米）过滤。滤饼在室温下过夜晾干，得到氧化石墨。将氧化石墨分散于双蒸水，常温下超声5小时，充分剥离后得到氧化石墨烯水溶液。

（二）氧化石墨烯铂纳米复合材料的制备：往9.225ml浓度为2mg/ml的氧化石墨烯溶液中加入0.575ml浓度为10mg/ml的氯铂酸水溶液，混匀剧烈搅拌15min后，逐滴加入0.2ml浓度为5mg/ml硼氢化钠水溶液，磁力搅拌4小时。得到的氧化石墨烯铂纳米复合材料水溶液呈深棕色，冷冻干燥得到氧化石墨烯铂纳米复合材料。以上过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。

（三）谷胱甘肽检测试剂盒：a液包括上述技术方案（二）制备后用双蒸水配制，浓度为11.5mg/l的氧化石墨烯铂纳米复合材料溶液，b液包括用10mmol/l，ph=5磷酸盐缓冲溶液配制的含浓度为26.7mmol/l的过氧化氢和浓度为0.13mmol/l3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液，标准贮备液包括浓度为0.4mmol/l的谷胱甘肽溶液。

（四）谷胱甘肽的检测方法

将技术方案（三）的标准贮备液用双蒸水稀释为0.004、0.04、0.1、0.2、0.3、0.4mmol/l的系列标准溶液，在200μl系列标准溶液中加入50μl技术方案（三）的a液和3.75ml技术方案（三）的b液，充分混匀后置于30°c水浴反应5分钟，测定652nm波长处的吸光度值，绘制谷胱甘肽标准曲线或计算回归方程。在200μl样品溶液中加入50μl技术方案（三）的a液和3.75ml技术方案（三）的b液，充分混匀后置于30°c水浴反应5分钟，测定652nm波长处的吸光度值，根据标准曲线进行定量。

本发明的优点：

（1）本发明基于谷胱甘肽可还原氧化态的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐，并可清除羟自由基的双重协同作用，抑制氧化石墨烯铂纳米复合材料仿生催化体系反应，用于谷胱甘肽的检测。

（2）本发明使用的氧化石墨烯铂纳米复合材料其制备过程快速、简便。

（3）本发明所构建的试剂盒与检测方法特异性好、灵敏度高、检测时间短，谷胱甘肽检测线性范围为0.02~20μmol/l，检测限低至4nmol/l。

附图说明

图1为谷胱甘肽与氧化石墨烯铂纳米复合材料催化体系作用后的紫外可见吸收光谱图。

图2为谷胱甘肽测定的标准曲线图。

具体实施方式

实施例1：

称取325目鳞片石墨1.2g，加入到144ml浓度为18.4mol/l的浓硫酸和16ml浓度为14.7mol/l的磷酸的混合溶液中。充分搅拌后，置于在0℃冰浴中。将7.2g高锰酸钾少量多次，缓慢加入到以上混合溶液中进行低温插层反应。保持0℃冰浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿色混悬液转移至35℃温水浴进行中温反应，控温反应1小时。再将得到的混悬液转移至50℃温水浴进行高温深度氧化，控温12小时。得到的紫黑色混悬液缓慢加入到160ml冰水混合物中，剧烈搅拌1小时。继而往溶液中逐滴滴加4.8ml30wt%过氧化氢溶液，溶液颜色突变为亮黄色。所得溶液经g1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤，滤液4000转/分钟离心30分钟，弃去上清液；在沉淀中加入80ml双蒸水充分振荡洗涤，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色呈土黄色；再加入80ml30wt%盐酸充分振荡洗涤，经g1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤去除不溶颗粒，滤液4000转/分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色继续加深；接着多次用无水乙醇将沉淀物洗至ph值为中性，4000转/分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀呈棕黄色；最后用乙醚冲洗沉淀，经g5砂芯漏斗（孔径1.5-2.5微米）过滤。滤饼在室温下过夜晾干，得到棕色的氧化石墨烯。取100mg氧化石墨溶解于50ml双蒸水，常温下超声5小时，充分剥离后得到2mg/ml透明澄清的棕黄色氧化石墨烯水溶液。

实施例2：

往9.225ml实施例1制得的浓度为2mg/ml的氧化石墨烯溶液中加入0.575ml浓度为10mg/ml的氯铂酸水溶液，混匀剧烈搅拌15min后，逐滴加入0.2ml浓度为5mg/ml的硼氢化钠水溶液，磁力搅拌4小时后即得。将得到的反应产物冷冻干燥得到氧化石墨烯铂纳米复合材料。

实施例3：

一种基于氧化石墨烯铂纳米复合材料作为仿生催化探针的谷胱甘肽检测试剂盒。试剂盒中包括提供氧化石墨烯铂纳米复合材料溶液（a液），3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐过氧化氢溶液（b液）和谷胱甘肽溶液（标准贮备液）。a液包括上述实施例2制备后用双蒸水配制，浓度为11.5mg/l的氧化石墨烯铂纳米复合材料溶液，b液包括用10mmol/l，ph=5磷酸盐缓冲溶液配制的含浓度为26.7mmol/l的过氧化氢和浓度为0.13mmol/l3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液，标准贮备液为浓度为0.4mmol/l的谷胱甘肽溶液。

实施例4：

在200μl双蒸水中分别加入50μl实施例3的a液和3.75ml实施例3的b液，充分混匀后置于30°c水浴反应5分钟，溶液呈明显蓝色，如图1所示，显色产物最大吸收波长为652nm。在200μl浓度为0.4mmol/l的谷胱甘肽溶液的标准贮备液中分别加入50μl实施例3的a液和3.75ml实施例3的b液，充分混匀后置于30°c水浴反应5分钟，测定紫外可见吸收光谱，如图1所示，在谷胱甘肽存在的情况下，催化显色体系的吸光度显著降低。

实施例5：

将实施例3的标准贮备液用双蒸水稀释为0.004、0.04、0.1、0.2、0.3、0.4mmol/l的系列标准溶液，在200μl双蒸水和系列标准溶液中加入50μl实施例3的a液和3.75ml实施例3的b液，充分混匀后置于30°c水浴反应5分钟，测定652nm波长处的吸光度值，双蒸水对照组的吸光度为a0，谷胱甘肽测定组的吸光度为a，以a0/a对谷胱甘肽浓度作图绘制谷胱甘肽标准曲线或计算回归方程。如图2所示，测定的线性范围为0.02~20μmol/l，回归方程相关系数为0.996，检测限为4nmol/l。

实施例6：

将实施例3的标准贮备液用双蒸水分别稀释为0.004mmol/l和0.1mmol/l的标准溶液，在200μl双蒸水和上述系列标准溶液中加入50μl实施例3的a液和3.75ml实施例3的b液，充分混匀后置于30°c水浴反应5分钟，测定652nm波长处的吸光度值，每个浓度平行测定6份，测定的标准偏差分别为0.5%和1.8%，表明本方法重现性良好。

实施例7：

取人溶血样品，13000rpm，4^oc超滤25分钟，滤液用双蒸水稀释5倍，在200μl人溶血样品稀释液中加入50μl实施例3的a液和3.75ml实施例3的b液，充分混匀后置于30°c水浴反应5分钟，测定652nm波长处的吸光度值，根据实施例6标准曲线进行定量，获得溶血样品中的谷胱甘肽含量。

实施例8：

取人溶血样品，13000rpm，4^oc超滤25分钟，滤液用双蒸水稀释2.5倍，在100μl人溶血样品稀释液中加入100μl不同浓度的谷胱甘肽标准液，50μl实施例3的a液和3.75ml实施例3的b液，充分混匀后置于30°c水浴反应5分钟，测定652nm波长处的吸光度值，根据谷胱甘肽标准曲线计算谷胱甘肽含量并计算回收率。如下表所示，本发明方法的回收率为95%-112.5%；

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。