一种艾氟康唑光学异构体的液相分析方法与流程

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种艾氟康唑光学异构体的液相分析方法。

背景技术：

艾氟康唑，化学名为(2r,3r)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(4-亚甲基哌啶-1-基)-1-(1h-1,2,4-三唑-1-基)-2-丁醇，是首个外用三唑类抗真菌药物，由加拿大valeant制药公司研发，2014年6月6日获fda批准上市，商品名jublia。该药为10％的溶液，局部涂用，主要用于治疗由红色毛癣菌、石膏样毛癣菌引起的手、足癣，其作用机制是抑制真菌14-去甲基化酶，从而干扰麦角甾醇的合成。艾氟康唑结构中存在2个手性中心，共有4种光学异构体，除具有药理活性的2r/3r构型(1)外，还有2s/3s构型(2)、2r/3s构型(3)和2s/3r构型(4)。

四种不同构型的化学结构式如下所示：

按照研发立体异构体新药的相关技术要求，有必要建立一套完善的分析方法对艾氟康唑的光学异构体杂质进行质量控制和产品质量评价。李佩杰提供了一种艾氟康唑中4种光学异构体的hplc测定方法(中国医药工业杂志,2016,47)，但是该方法采用的是手性色谱柱(daicelchiralpakic手性柱)。众所周知，手性色谱柱较为昂贵，且使用寿命短，使用手性色谱柱开发的液相分析方法具有较高的应用成本。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种更为经济的分离分析艾氟康唑及其异构体的液相分析方法。

本发明通过下面的技术方案得以实现：

一种艾氟康唑光学异构体的液相分析方法，液相色谱法的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈水溶液，乙腈体积百分浓度为25-45％，该乙腈水溶液中含有有效浓度的l-苏氨酸和d-苏氨酸，l-苏氨酸和d-苏氨酸的摩尔比为2-4:1。

优选地，l-苏氨酸、d-苏氨酸摩尔比为3:1。

优选地，所述l-苏氨酸、d-苏氨酸的摩尔浓度之和为0.3-0.5μmol/l。

优选地，所述的液相分析方法包括如下色谱参数：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶(c18)色谱柱；

流动相a相：25％乙腈水溶液，l-苏氨酸、d-苏氨酸分别为0.3μmol/l、0.1μmol/l；

流动相b相：45％乙腈水溶液，l-苏氨酸、d-苏氨酸分别为0.3μmol/l、0.1μmol/l；

洗脱程序：0-5min，0％b相；5-8min，0％→50％b相；8-10min，50％→100％b相；10-25min，100％b相；流速：0.7-0.9ml/min；

柱温：33-37℃；

检测波长：208-212nm。

优选地，流速为0.8ml/min。

优选地，柱温为35℃。

优选地，检测波长为210nm。

优选地，十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的规格为长250mm、内径4.6mm、填料粒径5μm。

优选地，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱优选thermoscientific^tmacclaim^tm120c18。

本发明的优点：

本发明提供的液相分析方法无需借助手性色谱柱，应用成本低，易于推广。

附图说明

图1为艾氟康唑及其异构体的化学结构式；

图2为混合对照品溶液使用实施例1液相分析方法的分离效果图；

图3为供试品溶液使用实施例1液相分析方法的分离效果图；

图4为混合对照品溶液使用实施例2液相分析方法的分离效果图；

图5为混合对照品溶液使用实施例3液相分析方法的分离效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步介绍本发明的技术方案。

实施例1艾氟康唑光学异构体的液相分析方法

一、实验材料

岛津lc-20a高效液相色谱仪；

cpa225d电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；

色谱柱：thermoscientific^tmacclaim^tm120c18；

艾氟康唑原料药自制，艾氟康唑(1)及其2s/3s(2)、2r/3s(3)、2s/3r(4)异构体的对照品自制(纯度大于98％)，艾氟康唑及其异构体的化学结构式如图1所示；

d-苏氨酸(cas号632-20-2，百灵威科技有限公司，纯度98％)；

l-苏氨酸(cas号6028-28-0，成都贝斯特试剂有限公司，纯度99％)；

乙腈为色谱纯，水为去离子水，其余试剂均为分析纯。

二、实验方法和结果

1、溶液配制

样品稀释剂：25％乙腈水溶液，含0.3μmol/l的l-苏氨酸、0.1μmol/l的d-苏氨酸。

对照品溶液：分别精密称取1-4对照品10mg，各置100ml量瓶中，用样品稀释剂溶解并定容，摇匀，即得浓度为100μg/ml的1-4对照品溶液。

混合对照品溶液：将1-4对照品溶液等体积混合，得浓度各25μg/ml的混合对照品溶液。

供试品溶液：精密称取艾氟康唑原料药100mg，置100ml量瓶中，用样品稀释剂溶解并定容，摇匀，即得浓度为1mg/ml的供试品溶液。

2、色谱条件

色谱柱：thermoscientific^tmacclaim^tm120c18；

流动相a相：25％乙腈水溶液，l-苏氨酸、d-苏氨酸分别为0.3μmol/l、0.1μmol/l；

流动相b相：45％乙腈水溶液，l-苏氨酸、d-苏氨酸分别为0.3μmol/l、0.1μmol/l；

洗脱程序：0-5min，0％b相；5-8min，0％→50％b相；8-10min，50％→100％b相；10-25min，100％b相；流速：0.8ml/min；

柱温：35℃；

检测波长：210nm；

进样量：20μl。

3、系统适用性试验

分别精密量取1-4对照品溶液和混合对照品溶液，进样测定，记录色谱图，出峰顺序依次为1、2、3、4，理论板数均大于10000，分离度均大于1.5，拖尾因子均小于1.15，空白溶剂不干扰测定，混合对照品溶液色谱图见图2。

4、线性关系考察

分别精密称取1-4对照品适量，用流动相分别溶解并稀释，制成0.5、5、10、20、50、80、100和120μg/ml的系列浓度溶液，进样测定。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程。异构体1-4在上述浓度范围内线性关系良好，r²＞0.9999。

5、灵敏度考察

精密称取1-4异构体对照品各适量，加稀释液溶解并稀释至4种异构体峰高约为基线噪音的3倍。结果各异构体的最低检出限均约为1.1×10^-3μg，灵敏度高。

6、加样回收率试验

按常规方法配制回收率测定溶液，计算各异构体的回收率，结果证明艾氟康唑4种异构体的回收率均在98-102％之间(rsd＜1.5％，n＝3)，符合要求。

7、精密度和稳定性试验

取上述混合对照品溶液和供试品溶液，分别连续进样6次，记录色谱图。结果rsd均小于2.0％(n＝6)，表明本方法精密度良好。

分别取上述混合对照品溶液和供试品溶液，于室温放置，分别于0、4、8、12、24h进样测定，记录色谱图。结果艾氟康唑4种异构体的峰面积在24h内的rsd均小于2.0％(n＝5)，表明混合对照品溶液室温放置24h稳定。

8、原料药测定

取样品适量，按上述方法制备混合对照品溶液和供试品溶液，分别进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有与混合对照品溶液色谱图中各异构体保留时间相同的杂质峰，按外标法以峰面积计算各异构体的含量。供试品溶液色谱图如图3所示。原料药中仅仅检出2s/3r(4)异构体，其在三批样品中的含量分别为0.04％、0.05％、0.04％。

实施例2对比实施例，流动相仅添加l-苏氨酸

一、实验材料

岛津lc-20a高效液相色谱仪；

cpa225d电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；

色谱柱：thermoscientific^tmacclaim^tm120c18；

艾氟康唑原料药自制，艾氟康唑(1)及其2s/3s(2)、2r/3s(3)、2s/3r(4)异构体的对照品自制(纯度大于98％)，艾氟康唑及其异构体的化学结构式如图1所示；

l-苏氨酸(cas号6028-28-0，成都贝斯特试剂有限公司，纯度99％)

乙腈为色谱纯，水为去离子水，其余试剂均为分析纯。

二、实验方法和结果

1、溶液配制

样品稀释剂：25％乙腈水溶液，含0.3μmol/l的l-苏氨酸。

对照品溶液：分别精密称取1-4对照品10mg，各置100ml量瓶中，用样品稀释剂溶解并定容，摇匀，即得浓度为100μg/ml的1-4对照品溶液。

混合对照品溶液：将1-4对照品溶液等体积混合，得浓度各25μg/ml的混合对照品溶液。

2、色谱条件

色谱柱：thermoscientific^tmacclaim^tm120c18；

流动相a相：25％乙腈水溶液，l-苏氨酸为0.3μmol/l；

流动相b相：45％乙腈水溶液，l-苏氨酸为0.3μmol/l；

洗脱程序：0-5min，0％b相；5-8min，0％→50％b相；8-10min，50％→100％b相；10-25min，100％b相；流速：0.8ml/min；

柱温：35℃；

检测波长：210nm；

进样量：20μl。

3、系统适用性试验

精密量取混合对照品溶液，进样测定，记录色谱图，结果艾氟康唑(1)、2s/3s(2)、2r/3s(3)、2s/3r(4)异构体不能实现两两分离，混合对照品溶液色谱图见图4。

实施例3对比实施例，流动相仅添加d-苏氨酸

一、实验材料

岛津lc-20a高效液相色谱仪；

cpa225d电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；

色谱柱：thermoscientific^tmacclaim^tm120c18；

艾氟康唑原料药自制，艾氟康唑(1)及其2s/3s(2)、2r/3s(3)、2s/3r(4)异构体的对照品自制(纯度大于98％)，艾氟康唑及其异构体的化学结构式如图1所示；

d-苏氨酸(cas号632-20-2，百灵威科技有限公司，纯度98％)；

乙腈为色谱纯，水为去离子水，其余试剂均为分析纯。

二、实验方法和结果

1、溶液配制

样品稀释剂：25％乙腈水溶液，含0.1μmol/l的d-苏氨酸。

对照品溶液：分别精密称取1-4对照品10mg，各置100ml量瓶中，用样品稀释剂溶解并定容，摇匀，即得浓度为100μg/ml的1-4对照品溶液。

混合对照品溶液：将1-4对照品溶液等体积混合，得浓度各25μg/ml的混合对照品溶液。

2、色谱条件

色谱柱：thermoscientific^tmacclaim^tm120c18；

流动相a相：25％乙腈水溶液，d-苏氨酸为0.1μmol/l；

流动相b相：45％乙腈水溶液，d-苏氨酸为0.1μmol/l；

洗脱程序：0-5min，0％b相；5-8min，0％→50％b相；8-10min，50％→100％b相；10-25min，100％b相；流速：0.8ml/min；

柱温：35℃；

检测波长：210nm；

进样量：20μl。

3、系统适用性试验

精密量取混合对照品溶液，进样测定，记录色谱图，结果艾氟康唑(1)、2s/3s(2)、2r/3s(3)、2s/3r(4)异构体不能实现两两分离，混合对照品溶液色谱图见图5。

本发明提供的液相分析方法无需借助手性色谱柱，应用成本低，易于推广。