一种基于Fe2+-H2O2-邻苯二胺体系的电化学传感分析方法与流程

本发明属于电化学生物分析技术领域，尤其涉及一种基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的电化学传感分析方法。

背景技术：

目前，业内常用的现有技术是这样的：

葡萄糖检测在从生物医学应用到生态学方法的各种领域中发挥着重要作用。葡萄糖是人体的重要指标，尤其是对糖尿病的评估。因此，血糖浓度的测定对于监测人体的生理状况至关重要。世界卫生组织(who)和美国糖尿病协会(ada)接受更简便，更低廉，可重复，灵敏且成本效益高的葡萄糖测试方法。在此基础上，已经开发了各种各样的基于不同信号产生原理的方法和策略用于葡萄糖浓度的检测，比如，基于化学发光的方法、基于荧光的方法、基于比色检测的方法。但是，大多数这些方法由于需要复杂昂贵的科学仪器和专业的操作人员，所以限制了它们的进一步应用。电化学检测方法由于其所具有的低成本，快速，高灵敏度和易于小型化等优点，有望用于进行免贵重仪器的分析方法的建立，其得到迅速的发展和应用，逐步成为应用最广泛的生物分析方法之一，涉及生物学检测的各个领域。目前，电化学方法，尤其是电流测量方法，已广泛应用于葡萄糖的传感分析。然而，这些用于葡萄糖检测的电化学策略大多基于非均相测定，需要对电极表面进行多步修饰和清洗，过程繁琐且耗时。而均相测定具有操作简单，响应快速和反应效率高等优点，因此，发展更快，更简单的无固定化电化学传感方法用于检测葡萄糖具有极其重要的意义。

亚铁离子(fe²⁺)是铁元素的离子形式之一，是天然酶的许多辅助因子中的重要金属离子，例如过氧化物酶，细胞色素氧化酶和脱氢酶。在酶催化反应中起着关键作用。作为活性过渡金属离子，fe²⁺还可以催化一些化学反应，如fenton反应。芬顿试剂具有非常强的氧化性能。当亚铁离子被h2o2氧化成三价铁离子时，会产生氢氧根离子和高活性的羟基自由基。由于芬顿试剂的氧化性能强，其受到了广泛的关注。近年来，fenton试剂被用于多种比色传感器和荧光传感器中以检测各种分析物，为发展高灵敏度的电化学检测葡萄糖的方法开阔了新的视野，其在生物分析方面展现出非常有希望的应用前景。fe²⁺作为催化剂，可催化h2o2氧化邻苯二胺(opd)生成具有电化学活性的2,2′-氨基偶氮苯(dap)，其可作为电化学信号指示剂。fenton试剂这种独特的氧化性能非常有利于构建用于检测葡萄糖高灵敏度无固定化的电化学传感器。因此，利用fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系进行电化学传感分析方法的开发具有重大的实际意义。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)用于检测葡萄糖的方法，如化学发光法、荧光法、比色法，这些方法需要复杂昂贵的科学仪器和专业的操作人员，且不易于小型化。

(2)目前用于葡萄糖检测的电化学策略大多基于非均相测定，需要对电极表面进行多步修饰和清洗，过程繁琐且耗时。

(3)大部分葡萄糖电化学传感器的选择性较差，因为在葡萄糖氧化的电位范围内，一些其他的糖和一些内源性干扰物也会被氧化。且灵敏度低，检测范围窄。

解决上述技术问题的难度：一种新型的高灵敏度、高选择性、无固定化的葡萄糖电化学传感器的构建。

解决上述技术问题的意义：公开一种基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系用于电化学均相检测葡萄糖的方法。与传统的葡萄糖传感器相比，其避免了贵重仪器的分析方法的建立；使用均相检测缩短了电化学响应的时间且避免了繁琐的电极修饰和清洗过程。本发明的葡萄糖测试方法更简便，更灵敏，选择性且成本效益更高，且易于小型化。为临床生物分子检测提供了一种简单、低廉、快速、高灵敏且性能稳定的检测新方法。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的电化学传感分析方法。

本发明是这样实现的，一种基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的电化学传感分析方法，具体包括以下步骤：

步骤一：将目标物葡萄糖、葡萄糖氧化酶混合孵育；

步骤二：将葡萄糖和葡萄糖氧化酶的反应液加入到hcl-naac缓冲液和氯化亚铁溶液中；

步骤三：加入邻苯二胺溶液，利用示差脉冲伏安法对混合液进行定量检测。

进一步，步骤一中，孵育温度为37℃、时间为1h。目标物葡萄糖与葡糖糖氧化酶的反应温度及时间控制，有利于两者反应完全，避免未反应完全所造成的检测误差。

进一步，步骤一中，葡萄糖氧化酶的浓度为1mg/ml，用量为13μl。葡萄糖氧化酶的浓度及用量控制，保证对目标物的完全催化而无浪费。

进一步，步骤一中，不同浓度葡萄糖用量为27μl。在实现检测的前提下，达到微量检测的目的，实现对目标样品的微损检测。

进一步，步骤二中，氯化亚铁的浓度为10mm,用量为20μl。铁离子浓度及用量的控制，保证电化学响应信号峰值且无浪费(见图5)。

进一步，步骤二中，缓冲液为0.1mhcl-naac，ph为3.0，用量为80μl。检测底液ph控制亦是为了获得响应信号峰值(见图6)。

进一步，步骤三中，邻苯二胺的浓度为18mm，用量为200μl。邻苯二胺浓度及用量控制保证信号获取及放大效果(见图7)。

进一步，步骤三中，示差脉冲伏安法的扫描电位范围为0.1v～-0.7v。本方法中响应信号出峰位置为-0.3v附近，为了更好展示响应信号峰将扫描电位范围延展±0.4v。

本发明的基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的葡萄糖电化学传感分析方法的测定原理是：最初，葡萄糖氧化酶将葡萄糖转化成葡萄糖酸，同时产生h2o2。形成的h2o2与亚铁离子(fe²⁺)反应，产生高活性的羟基自由基(·oh)，·oh进一步催化氧化邻苯二胺(opd)生成具有强电化学活性的2,2′-氨基偶氮苯(dap)，其颜色从无色变为黄色。随着葡萄糖浓度的增加，生成具有电化学活性的2,2′-氨基偶氮苯的量不断增大，dpv信号响应强度也就不断增强，从而达到定量检测葡萄糖的目的。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

(1)本发明提供了一种基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系用于电化学均相检测葡萄糖的方法，其电化学响应时间小于10s，检测范围为0.1μm到10000μm，比现有电化学分析方法用于检测葡萄糖的检测范围宽(talanta.2018,182:230-240)，且在常见干扰物如抗坏血酸(aa)、多巴胺(da)、尿酸(ua)、谷氨酸(glue)的存在下，对葡萄糖均具有良好的选择性(见图4)。

(2)与其他电化学分析方法(jcolloidinterfacesci.2018,511:355-64)检测葡萄糖相比，由于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺可以产生具有非常强的电化学响应，使得其对葡萄糖检测的灵敏度大大的提高，其检测限达到了0.15μm。

(3)本发明与生物催化反应密切相关。通过利用fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的电化学传感分析方法，不仅可用于葡萄糖的定量检测，还可以扩展到分析一系列高敏感性和特异性的生物标志物/相应的氧化酶，如尿酸(ua)/尿酸氧化酶(uox)，肌氨酸(so)/肌氨酸氧化酶(sox)，胆碱(co)/胆碱氧化酶(cox)，乳酸(la)/乳酸氧化酶(lox)，黄嘌呤(xo)/黄嘌呤氧化酶(xox)等目标物。

本发明通过电化学传感示差脉冲伏安法对葡萄糖的浓度进行高灵敏性的定量检测，涉及均相电化学检测，操作简单，无需繁琐的电极修饰和清洗过程，检测方法简便、快速、检测范围广、灵敏度和选择性高，为临床生物分子检测提供了一种简单、低廉、快速、高灵敏且性能稳定的检测新方法。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的葡萄糖电化学传感分析方法流程图。

图2是本发明实施例提供的基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的葡萄糖电化学传感分析方法原理示意图。

图3是本发明实施例提供的基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的葡萄糖分析方法电化学检测葡萄糖的结果示意图。

图4是本发明实施例提供的基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的葡萄糖分析方法电化学检测葡萄糖的选择性实验结果示意图。

图5是本发明实施例提供的基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的葡萄糖分析方法电化学检测葡萄糖的铁离子浓度优化结果示意图。

图6是本发明实施例提供的基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的葡萄糖分析方法电化学检测葡萄糖的ph优化结果示意图。

图7是本发明实施例提供的基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的葡萄糖分析方法电化学检测葡萄糖的邻苯二胺浓度优化结果示意图。

图8是本发明实施例提供的基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的葡萄糖分析方法电化学检测葡萄糖的铁离子-邻苯二胺共增强信号响应结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的目的在于提供一种基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的电化学传感分析方法，以葡萄糖检测为例；由于fe²⁺催化h2o2氧化邻苯二胺生成具有电化学活性的2,2′-氨基偶氮苯后，其在电极表面产生氧化还原峰电流，导致电流响应信号大小随着h2o2浓度的变化而变化；利用这个特点，可以建立一种简单、低廉、快速、灵敏且性能稳定的基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的葡萄糖电化学传感分析的新方法。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细说明；

如图1所示，本发明实施例提供的基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的电化学传感分析方法，具体包括以下步骤：

s101：将目标物葡萄糖、葡萄糖氧化酶混合孵育；

s102：将葡萄糖和葡萄糖氧化酶的反应液加入到hcl-naac缓冲液和氯化亚铁溶液中；

s103：加入邻苯二胺溶液，利用示差脉冲伏安法对混合液进行定量检测。

步骤s101中，本发明实施例提供的孵育温度为37℃、时间为1h。

步骤s101中，本发明实施例提供的葡萄糖氧化酶的浓度为1mg/ml，用量为13μl。

步骤s101中，本发明实施例提供的不同浓度葡萄糖用量为27μl。

步骤s102中，本发明实施例提供的氯化亚铁的浓度为10mm，用量为20μl。

步骤s102中，本发明实施例提供的缓冲液为0.1mhcl-naac，ph为3.0，用量为80μl。

步骤s103中，本发明实施例提供的邻苯二胺的浓度为18mm，用量为200μl。

步骤s103中，本发明实施例提供的示差脉冲伏安法的扫描电位范围为0.1v～-0.7v。

本发明实施例提供的基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的葡萄糖电化学传感分析方法的测定原理：

葡萄糖氧化酶催化水解葡萄糖生成葡萄糖酸和h2o2，形成的h2o2与亚铁离子(fe²⁺)反应，产生高活性的羟基自由基(·oh)，·oh进一步催化氧化邻苯二胺(opd)生成具有强电化学活性的2,2′-氨基偶氮苯(dap)，其颜色从无色变为黄色；随着葡萄糖浓度的增加，生成具有电化学活性的2,2′-氨基偶氮苯的量不断增大，示差脉冲伏安法(dpv)信号响应强度也就不断增强，从而达到定量检测葡萄糖的目的。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理进行进一步说明；

实施例1；一种基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的电化学传感分析方法，以检测葡萄糖为例；

基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的电化学传感分析方法均相检测葡萄糖；

27μl一系列浓度的葡萄糖标准样品分别和13μl的1mg/ml葡萄糖氧化酶溶液混匀后，在37℃下孵育1小时。所得的含有h2o2的反应液加入含有80μl，0.1mhcl-naac(ph3.0)、20μl，10mmfecl2的混合液中，最后加入200μl，10mmopd，然后，通过电化学工作站记录这些溶液的示差脉冲伏安电流响应变化，根据电流响应信号的大小和葡萄糖浓度变化的关系绘制标准工作曲线。

如图2所示，本发明实施例提供的基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的葡萄糖电化学传感分析方法原理示意图。

如图3所示，本发明实施例提供的基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的葡萄糖分析方法电化学检测葡萄糖的结果示意图。

如图4所示，本发明实施例提供的基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的葡萄糖分析方法电化学检测葡萄糖的选择性实验结果示意图。

如图5所示，本发明实施例提供的基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的葡萄糖分析方法电化学检测葡萄糖的铁离子浓度优化结果示意图。

如图6所示，本发明实施例提供的基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的葡萄糖分析方法电化学检测葡萄糖的ph优化结果示意图。

如图7所示，本发明实施例提供的基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的葡萄糖分析方法电化学检测葡萄糖的邻苯二胺浓度优化结果示意图。

如图8所示，本发明实施例提供的基于fe²⁺-h2o2-邻苯二胺体系的葡萄糖分析方法电化学检测葡萄糖的铁离子-邻苯二胺共增强信号响应结果示意图。

图中，(a)dpv响应曲线图；(b)标准工作曲线图。

本发明可以通过电化学传感示差脉冲伏安法对葡萄糖的浓度进行高灵敏性的定量检测，随着葡萄糖浓度的增加，电流响应信号不断增大，对葡萄糖的检测限为0.15μm，线性范围是0.1μm～10000μm。本发明涉及均相电化学检测，操作简单，无需繁琐的电极修饰和清洗过程，检测方法简便、快速、灵敏度高，为临床生物分子检测提供了一种简单、低廉、快速、高灵敏且性能稳定的检测新方法。实验数据见图3-图8。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。