一种检测蜂蜜中甘油含量的测定方法与流程

本发明属于食品医药的检测领域，尤其涉及蜂蜜中甘油含量的高效液相色谱检测方法。

背景技术：

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜，混以自身分泌物经充分酿造而成的甜物质。蜂蜜主要成分为果糖，葡萄糖，水分，还含有相对少量的蛋白质、氨基酸、脂肪酸、酚类化合物、维生素、矿物质等营养保健物质，本草纲目认为蜂蜜具有清热、解毒、补中、润肠、和百药的药理功能。蜂蜜安全性高，是百姓喜爱的流行食品。

由于蜂蜜市场供不应求，所以现在蜂蜜的采收以非成熟蜜为主，非成熟蜜的特点是水分含量较高，约30％～40％，这种蜂蜜极易发酵，从而影响蜂蜜品质。发酵的蜂蜜除了会产生乙醇、丙二醇和二氧化碳外，还会产生少量的甘油，甘油在蜂蜜加工时无法去除，故国外对蜂蜜中的甘油进行限量，以保证蜂蜜的品质。我国由中国蜂产品协会起草的蜂蜜团体标准中，对特级蜂蜜中的甘油限量进行了规定要求不超过300mg/kg。

目前，蜂蜜中甘油的主要检测方法有：分光光度法，气质联用法，食品、药品等其他产品中甘油的测定方法还有：液相色谱法、氧化还原滴定法、比色法、红外光谱法、液相色谱串联质谱法等，未见用液相色谱法检测蜂蜜中甘油的文献报道。其中，分光光度法，需要配制大量的试剂，连续测定空白溶液、蜂蜜试样测定液和标准溶液的吸光度各10次，以得到相对稳定的吸光度值，操作步骤烦琐，对环境的要求较高。而气质联用法，虽不需要净化处理，但操作需要衍生化，颜色深的蜂蜜会产生干扰，不利于准确定量，而且仪器昂贵。这两种方法对操作人员要求较高，不适合大多数企业使用，企业均需要送外部专门的检测机构检验，提高了企业的质量成本，不利于产品竞争。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种即可满足小微企业在日常工作中对蜂蜜中甘油含量的控制，也可为检测其他产品中甘油样品浓缩与净化方法提供参考。

为实现发明目的，本发明采取如下的技术手段：

一种检测蜂蜜中甘油含量的测定方法，将蜂蜜先用乙醇溶解，然后将蜂蜜乙醇溶液分散在微粉硅胶中，经过乙腈提取、浓缩、富集，用流动相溶解富集物，用高效液相色谱法，采用色谱柱分离，以赤藓糖醇为内标，测定甘油含量。

上述的检测蜂蜜中甘油含量的测定方法，包括如下步骤：

s1.标准溶液配制

赤藓糖醇使用液：赤藓糖醇用95％乙醇配制；

甘油贮备标准溶液：甘油用双重蒸馏水稀释配制；

甘油工作标准溶液：甘油贮备标准溶液用流动相配制；

s2.供试品溶液制备

称取蜂蜜样品，加赤藓糖醇使用液，加乙醇，加微粉硅胶，搅拌充分分散成细微颗粒，沸水浴蒸干，加乙腈，混匀，超声，离心，吸取上清液，旋转蒸发至干，加流动相，超声，过滤，得到供试品溶液；

s3.阴性基质标准曲线工作溶液的制备

称取蜂蜜样品，加赤藓糖醇使用液，加入甘油工作标准液，加入乙醇，搅拌均匀至完全溶解，加入微粉硅胶，搅拌充分分散成细微颗粒，沸水浴蒸干，加乙腈，混匀，超声，离心，吸取上清液，旋转蒸发至干，加流动相，超声，过滤，得到阴性基质标准曲线工作溶液；

s4.液相色谱分析条件

色谱柱:kromasil100-5-nh24.6mm×250mm×5μm或等效色谱柱；流动相:90％乙腈水溶液；流速:1.0ml/min；柱温:30℃；检测室温度:35℃；进样量:40μl；

s5.测定

用阴性基质标准曲线工作溶液、供试品溶液分别进样，以甘油与赤藓糖醇峰面积比值为纵坐标，以标准工作溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量。

作为优选，所述的流动相为乙腈水溶液，体积浓度为70-100％。

作为优选，所述的赤藓糖醇使用液的浓度为50mg/ml；所述甘油贮备标准溶液的浓度为200mg/ml；所述甘油工作标准溶液的浓度为2.5mg/ml，10mg/ml。

作为优选，s2.供试品溶液制备中，蜂蜜样品为5.00g，赤藓糖醇使用液500μl，乙醇6ml，微粉硅胶3.5g，乙腈20ml，超声30min，3000rpm离心5min，1ml流动相。

作为优选，s3阴性基质标准曲线工作溶液的制备中，称取5份蜂蜜样品5.00g，各加入赤藓糖醇使用液500μl，各加入2.5mg/ml甘油工作标准液100μl、200μl，加入10mg/ml甘油工作标准液100μl、200μl、500μl，各加入乙醇6ml，微粉硅胶3.5g，搅拌充分分散成细微颗粒，于100℃下沸水浴蒸干，转入50ml塑料离心管中，加入乙腈20ml，混匀，超声30min，离心3000rpm5min，吸取上清液，过滤于50ml玻璃离心管中，残渣中再加入乙腈10ml重复提取一次，过滤，合并过滤液，旋转蒸发至干，加1ml流动相，超声溶解，经0.22μm滤膜过滤，得到阴性基质标准曲线工作溶液，相当于标准溶液系列浓度为250mg/l、500mg/l、1000mg/l、2000mg/l、5000mg/l。

本文研究了蜂蜜中甘油含量的测定方法，确定了采用内标法定量的可行性，首次用乙腈、微粉硅胶联合使用净化样品，首次选择确定了以赤藓糖醇为内标的定量方法，该方法前处理方法简单，色谱分离度好，无干扰，使用内标法定量，结果准确可靠，方法灵敏度好，检测限达到20mg/kg。可满足小微企业在日常工作中对蜂蜜中的甘油含量进行控制，也可以为检测其他产品中甘油时样品浓缩与净化方法提供参考。

附图说明

图1是40％乙腈溶解蜂蜜样品的色谱图；

图2是蜂蜜样品的色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步描述。虽然本发明已以实施例公开如下，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，或者将本发明的前处理净化技术应用于其他仪器分析，均应属于本发明的保护范围。

实施例

实验部分

1.1仪器与试剂

shimadzulc-20a型高效液相色谱仪(包括在线脱气机、二元泵、手动进样器、柱温箱、示差折光检测器)；sartoriusbs224s分析天平；甘油标准品(纯度99％，中国药品生物制品检定所)；微粉硅胶为医药级，纯度大于99％；赤藓糖醇内标纯度大于99％；95％乙醇为分析纯；乙腈为hplc级；双重蒸馏水。实验样品：蜂蜜(北京百花蜂业科技发展股份有限公司提供)。

本文中涉及到的浓度为液体的，均是体积浓度。

1.2检测蜂蜜中甘油含量的测定方法，包括如下步骤：

s1.标准溶液配制

赤藓糖醇使用液：称取0.5g赤藓糖醇于10m1容量瓶中，用95％乙醇稀释、摇匀，浓度：50mg/ml。密封4℃下保存期24个月。

甘油贮备标准溶液：称取2g甘油于10ml容量瓶中，用双重蒸馏水稀释、摇匀，浓度为200mg/ml。密封4℃下保存期24个月。

甘油工作标准溶液1：取甘油贮备标准溶液1ml于20ml容量瓶中，用流动相稀释、摇匀，浓度为10mg/ml。密封4℃下保存期12个月。

甘油工作标准溶液2：取甘油贮备标准溶液5ml于20ml容量瓶中，用流动相稀释、摇匀，浓度为2.5mg/ml。密封4℃下保存期12个月。

s2.供试品溶液制备

称取蜂蜜样品5.00g于90mm蒸发皿中，加入赤藓糖醇使用液500μl，加入乙醇6ml，搅拌均匀至完全溶解，加入3.5g微粉硅胶，搅拌充分分散成细微颗粒，于100℃下沸水浴蒸干，转入50ml塑料离心管中，加入乙腈20ml，混匀，超声30min，离心3000rpm5min，吸取上清液，过滤于50ml玻璃离心管中，残渣中再加入乙腈10ml重复提取一次，过滤，合并过滤液，旋转蒸发至干，加1ml流动相，超声溶解，经0.22μm滤膜过滤。

s3.阴性基质标准曲线工作溶液的制备

称取5份蜂蜜样品5.00g于90mm蒸发皿中，各加入赤藓糖醇使用液500μl，各加入2.5mg/ml甘油工作标准液100μl、200μl，加入10mg/ml甘油工作标准液100μl、200μl、500μl，各加入乙醇6ml，微粉硅胶3.5g，搅拌充分分散成细微颗粒，于100℃下沸水浴蒸干，转入50ml塑料离心管中，加入乙腈20ml，混匀，超声30min，离心3000rpm5min，吸取上清液，过滤于50ml玻璃离心管中，残渣中再加入乙腈10ml重复提取一次，过滤，合并过滤液，旋转蒸发至干，加1ml流动相，超声溶解，经0.22μm滤膜过滤，得到阴性基质标准曲线工作溶液，相当于标准溶液系列浓度为250mg/l、500mg/l、1000mg/l、2000mg/l、5000mg/l。

s4.液相色谱分析条件

色谱柱:kromasil100-5-nh24.6mm×250mm×5μm。或等效色谱柱。

流动相:乙腈：水＝90：10(体积比)

流速:1.0ml/min。

柱温:30℃。

检测室温度:35℃。

进样量:40μl。

s5.测定

用阴性基质标准曲线工作溶液、供试品溶液分别进样，以甘油与赤藓糖醇峰面积比值为纵坐标，以标准工作溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量标准工作溶液及试样溶液中甘油与赤藓糖醇的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，甘油的参考保留时间为7.78min，赤藓糖醇的参考保留时间为11.24min。

1.3结果计算与表示

结果计算

试样中甘油含量(x)以毫克每千克(mg/kg)表示，按式(1)计算：

式中：

cs—从甘油标准工作曲线上计算得到的浓度，单位为毫克每升(mg/l)；

v—样液最终稀释体积，单位为毫升；

m—样品质量，单位为克(g)。

结果表示

将符合重复性要求的两个独立测定值的算术平均值作为测定结果(mg/kg)，保留三位有效数字。

2.1结果与讨论

2.1.1样品净化方法优化

蜂蜜中的甘油含量可在0～3000mg/kg之间，欧盟要求蜂蜜中的甘油限量为200mg/kg，采用液相色谱检测药品、食品等文献报道，样品前处理方法主要有：用稀硫酸调ph＝4～6，水油分离，树脂净化；直接用水稀释；用72％乙醇提取；直接过滤进样等，这些文献报道的方法的共同点是：除了油性、干性产品外，水性产品均无法对样品进行净化达到富集甘油，提高检测灵敏度的目的。究其原因是甘油与水、糖类、醇类、酸类、酯类等多数物质可以任意比例混溶，很难找到一种有效的净化富集的样品处理方法。

蜂蜜中主要成分是糖类与水，占蜂蜜的90％以上，甘油可以很好地溶解在两者中。蜂蜜中的蛋白质含量在1％以下，对蜂蜜进行去蛋白质处理意义不大，我们曾采用水稀释法进行样品检测，发现甘油出峰处有干扰存在，同时灵敏度不能达到要求。

乙腈与糖类化合物的溶解度随糖类化合物中水分含量的减低而减少。我们根据这个特性，将蜂蜜用较大量的乙腈提取，但是情况并不理想，原因是蜂蜜太过粘稠，无法很好地进行液液萃取操作，加之糖与甘油的溶解度也很高，要用乙腈萃取出蜂蜜中的甘油是不可行的。

固液分散萃取是利用萃取剂提取固体中的可溶组分(溶质)，因而溶质在固体中的分布情况直接影响到固液萃取的速率。微粉硅胶是一种极细微粉末，粒径小于45μm，可作为药用辅料，具有一定的吸附性能，在药品制备中起到抗结块作用，是一种助流剂。将蜂蜜分散在微粉硅胶使成细粉，增加乙腈与样品中甘油的接触面积，可以提高萃取效率。将细粉在水浴上去除水分，可以消除甘油在水中的溶解因素，减少糖类化合物在乙腈中的溶出，达到甘油富集效果。同时使用乙醇预先溶解蜂蜜，可以促进蜂蜜更充分地分散在微粉硅胶中，从而保证甘油有效地溶出到乙腈中。

进过试验，最佳样品净化方法是：称样量5g，加6ml乙醇溶解蜂蜜，倒入3.5g微粉硅胶用玻璃捧充分搅拌使物料成为极细均匀粉末，无肉眼可见结块，于100℃沸水浴蒸干，冷却至室温后，用20ml乙腈混匀，进行超声提取。通过本文的方法提取净化，将乙腈蒸干后，瓶壁上只留下薄薄的一层痕迹，加入流动相溶解后，样液呈无色、澄清、透明状态，样品得到有效净化。

2.1.2液相条件选择

甘油可经nh2色谱柱进行分离并用示差或者蒸发光散射检测器检测已经有较多的文献报道。本文选择kromasil100-5-nh2色谱柱，以乙腈水溶液作为流动相，对蜂蜜中甘油的液相色谱分析条件进行研究。

我们分别用70％，80％和90％乙腈对甘油进行分离，发现90％乙腈时，甘油出峰时间在7.8min，与溶剂峰完全分离，可以用于定量分析。

为便于甘油的溶解，我们先是选择了40％的乙腈作为处理后的样品的溶解液，发现甘油后面存在一个色谱峰，虽然分离度较好，不影响定量，但是，色谱峰峰形不尖锐，色谱图见图1。原因是流动相与溶解液中乙腈浓度存在较大差异，在检测时，示差检测器的参考池中的液体浓度与检测池不同，影响仪器信号输出，导致峰形变宽。

为此，我们采用流动相溶解样品，溶解样品时为了使甘油充分溶解到流动相中，增加了超声溶解步骤。用流动相溶解后的样液进样，发现甘油色谱峰变得尖锐，峰宽变窄，基线噪音大幅下降，大大提高了方法灵敏度。色谱图见图2。

2.1.3方法稳定性研究

精密称取含甘油的蜂蜜样品5g，按1.3要求对样品进行操作处理，在室温下，设置仪器样品批处理文件，分别在0，1，2，4，8，16h等6个时间段按s4方法进样测定，记录甘油色谱峰峰面积，rsd＝2.81％(n＝6)，符合gb/t27404对检测结果精密度的要求。表明处理后的样液在16h内稳定性良好。

2.1.4方法的线性范围、回收率、精密度和检出限

以甘油含为阴性的蜂蜜样品作为阴性基质样品，分别添加相当于50mg/kg，100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg，1000mg/kg的甘油，旋涡混合2min，在优化实验条件下，对阴性基质样品进行处理和测定，以甘油峰面积与加入赤藓糖醇峰面积的比值(y)对质量浓度(x，mg/kg)绘制工作曲线，结果见表3。结果表明，甘油在50mg/kg～1000mg/kg范围内线性良好，相关系数为0.9979，满足定量分析要求。以s/n＝3计算检出限(lod)，结果见表1。

表1甘油的线性范围、回归方程、相关系数和检出限：

在蜂蜜空白样品中添加3个水平的甘油标准溶液，按照“s2.供试品溶液制备”方法处理后做回收率实验，每个添加水平重复测定3次，添加回收率及其相对标准偏差见表2。

表2空白蜂蜜中甘油的加标回收率和精密度：

本发明建立了用乙醇溶解样品，经微粉硅胶吸附，乙腈提取，过滤、蒸干，用流动相溶解，经高效液相色谱示差检测器测定蜂蜜中甘油的检测方法。在阴性蜂蜜基质中回收率在94％～98％，相对标准偏差4.2％-～6.0％。本方法简便、快速、重复性好、准确度高，是检测蜂蜜中甘油简便实用的方法。

3.1实际样品的测定。

按本文建立的方法对蜂蜜原料和成品样品测定，结果见表3。

表3各种蜂蜜样品中甘油含量测定结果