一种基于适配体修饰的纳米多孔金的双酚a传感器及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于电化学检测领域，特别设及一种基于适配体修饰的纳米多孔金的双酪 A传感器及方法。
【背景技术】
[0002] 双酪A炬PA)是聚碳酸醋聚合物和环氧树脂的合成过程中的一种重要的有机单 体，其广泛存在于食品储存和包装材料中，包括婴幼儿奶瓶、饮用水瓶、餐具和食品罐头的 内部涂层等。随着BPA在食品及环境领域的广泛应用与渗入[1]，人们对BPA的危害性产 生了顾虑巧][3]。实际上，BPA是一种有害的内分泌干扰物质，因其结构与激素相类似，它 可W冒充雌激素并且干设雌激素与雌激素受体间的正常结合巧]，从而导致人体内分泌系 统素乱，尤其是对婴幼儿和孕妇会产生明显的危害[4]。最新的研究调查显示，BPA与肥胖 症、神经中毒、甚至是癌症的病发都有潜在的关联[5] [6]。因此，人体液中BPA的检测对于 控制其对人体的危害有非常重要的意义。但是，生物样本中基体效应的干扰加大了 BPA的 检测难度。当下急需开发出一种快速的、简便的、高灵敏度、高选择性、稳定的检测方法来检 测人体液中痕量的BPA。
[0003] 当前BPA的检测方法有很多，但是大多数都是基于色谱技术[7]，比如液相色谱 法巧]、高效液相色谱法巧]、液相色谱-质谱联用法[10]和气相色谱-质谱联用法[11]。 近几年，一些其他的检测方法陆续被应用于BPA的检测，如酶联免疫吸附分析法巧LISA) [12]、分子印迹技术[13]、比色法[14]和电化学传感器[1引等等。在该些已被报道的方法 中，电化学传感器因其装置低廉、操作简便、检测迅捷、操作成本低、灵敏度高、稳定性强、适 合于真实样品的检测等诸多优势激发了广泛的研究兴趣[16]。由于BPA的电化学活性来 源于它的酪哲基，直接的电化学检测成为了可能。为了加强检测信号，具有电化学催化性能 的纳米材料常被用于催化BPA的氧化还原反应，如纳米金颗粒[17]、量子点[1引、碳纳米管
[19]和石墨締[1引巧0]巧1]。但是，许多其他酪类物质的反应也会被上述的纳米材料所催 化，从而干扰了 BPA的检测。为了提高检测的选择性，一些生物分子被用来作为识别元件， 包括抗体巧2]、适配体巧3]、肤链巧4]和雌激素受体巧引。Ragavan等人指出BPA的检测 迫切需要的是一种灵敏度高、选择性好的简便的传感器[16]。因此，寻找一种兼具高效的电 催化作用和优异的生物兼容性的纳米材料是发展BPA检测方法的关键。
[0004] 脱合金法制备纳米多孔金（NPG)自2004年被报道W来获得了广泛的关注巧6]。 NPG是一种双向连续的多孔结构，纳米孔和金骨架完全联通，有一定的机械强度，化学性质 稳定、导电性出众、生物兼容性良好。它所具备的高效的催化性质和光学性质已被广泛地应 用于多个研究领域巧7]巧引。另外，它还对小分子物质展现出了优异的电催化性质巧9] [30]。但是，将具有优异的电催化作用的NPG和特异性生物分子识别元件相结合，用于设计 高灵敏度和高选择性的电化学传感器实现BPA的检测，到目前为止从未被报道。基于NPG 的诸多优势，其在电化学传感器领域具有非常大的应用潜力和价值。
【发明内容】
[0005] 针对上述问题，我们开发了一种基于适配体修饰纳米多孔金NPG的生物传感器， 对双酪A炬PA)进行直接电化学检测。NPG用脱合金法制得，并用于修饰玻碳电极（GCE)。然 后，再用对BPA有特异性识别作用的适配体（aptamer)修饰NPG/GCE，传感器的制备工作便 完成。我们用扫描电镜法（SEM)和X射线光电子光谱法狂P巧对该传感器的制备过程进行 了表征，并用循环伏安法（CV)对BPA在NPG/GCE上的电化学行为进行了研究。本实验还对 一些重要的实验参数进行了优化，包括适配体浓度、反应时间、抑和温度。该一新型的传感 器对于磯酸盐缓冲溶液（PB巧中和实际样品中的BPA浓度的检测结果通过差分脉冲伏安法 值PV)获得。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种基于适配体修饰的纳米多孔金的双酪A传感器，包括对电极、参比电极和工 作电极，所述的工作电极为表面修饰了双酪A适配体/纳米多孔金的玻碳电极，制备方法如 下：
[0008] 1)将玻碳电极GCE用氧化侣粉末在鹿皮革上研磨至镜面抛光度，超声洗漆后，再 分别用超纯水和己醇浸洗；
[0009] 2)将脱合金法制得的纳米多孔金NPG平铺到GCE表面，得到的NPG/GCE;
[0010] 如将活化后的BPA适配体滴至NPG/GCE上，静置10-12h，使适配体通过S-Au键固 定在NPG上，即得aptamer/NPG/GCE传感器探针。
[0011] 优选的是，所述的对电极为销电极，所述的参比电极为银/氯化银电极。
[0012] 本发明还提供了一种基于适配体修饰的纳米多孔金的双酪A传感器的制备方法， 其特征在于，具体步骤如下：
[0013] 1)将玻碳电极GCE用氧化侣粉末在鹿皮革上研磨至镜面抛光度，超声洗漆后，再 分别用超纯水和己醇浸洗；
[0014] 2)将脱合金法制得的，得到的NPG/GCE;
[0015] 3)将BPA适配体滴至NPG/GCE上，静置过夜，即得aptamer/NPG/GCE传感器探针， 并用TE缓冲液洗漆后置于4°C的冰箱内储存待用。
[0016] 优选的是，步骤2)中，所述将NPG平铺到GCE表面的具体方法是：用玻碳电极将 漂浮在水上的NPG膜撰起，使NPG膜吸附到玻碳电极表面。
[0017] 优选的是，步骤3)中，所述BPA适配体的滴加量为4~8 y L。
[0018] 一种应用上述的传感器检测双酪A浓度的方法，包括W下步骤：将生物传感器浸 入待测样品中，根据相应电流值与双酪A浓度的定量关系，确定待测样品中双酪A的浓度。
[0019] 本发明的有益效果；
[0020] 1.在该工作中，我们开发了一种基于NPG纳米材料的适配体传感器，用于BPA的直 接电化学检测。该电极的检测限低至0. 056 + 0. 004nM BPA，低于绝大多数已报道的电化学 检测方法。该传感器还对BPA显示出了出色的选择性和长期的稳定性。另外，该传感器已 经成功应用于人血清样本中BPA的检测，该意味着其在临床诊断领域有着值得瞩目的应用 前景。
[0021] 2.本发明制备过程简单、成本低，制备的检测结果稳定性高，重现性和检测精度 局。
【附图说明】
[0022] 图1. (a) NPG/GCE，（b) GCE，（C)金盘电极在含有200 y M BPA的PBS溶液中的CV扫 描图，（d)NPG/GCE在PBS溶液中的CV扫描图；内置图为NPG/GCE在含有50 uM BPA的PBS 溶液中的多圈CV扫描图。
[0023]图2. NPG的沈M表征图像（A和C)，aptamer/NPG的沈M表征图像炬和D);似NPG/ GCE 和 aptamer/NPG/GCE 的 XPS 表征光谱图；（F) (a)aptamer/NPG/GCE 和 〇3)BPA/aptame;r/ NPG/GCE在PBS溶液中的CV扫描图。
[0024] 图3. (A)在0. 1MPBS溶液中，BPA/aptamer/NPG/GCE在不同扫速下的CV图，炬） 峰电流与扫速的线性拟合图。
[00巧]图4. (A)aptamer/NPG/GCE传感器对不同浓度的BPA溶液的DPV检测结果（(a) 0， 化）0. 1，（C) 1. 0,（d) 10. 0,（e) 20. 0,（f) 50. 0,（g) 100. 0,化）150.OnM);炬）aptamer/NPG/GCE 传感器检测不同浓度BPA得到的标准曲线。
[0026] 图5.aptamer/NPG/GCE传感器对不同分析物的DPV扫描结果图。
[0027] 图6.基于纳米多孔金的适配体传感器的制备流程及BPA直接电化学检测原理
【具体实施方式】
[0028] W下通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规的方法和条件进行选 择。实施例1
[002引1、实验部分
[0030] 2. 1化学试剂与材料
[003。 BPA购于阿拉了试剂有限公司（中国，上海）。一种可W对BPA实现特异性识别的 5-琉基化 BPA 适配体保-CCG GTG GGT GGT CAG GTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3'K31]由 Invitrogen 生物科技有限公司（中国，北京） 合成制得。人血清样品从健康的志愿者体内采集。PBS由0. 01M的磯酸氨二钢、0. 0