生物活性多肽的分析测试和鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蛋白领域，具体涉及一种鉴别发酵乳中生物活性多肽的方法。
【背景技术】
[0002] 迄今为止鉴定生物活性肽常用的方法中，通常以某种生物活性为导向，在每次分 离后，鉴定活性并取活性较强部分，再次分离纯化，最终鉴定活性强的部分产物中的多肽。 Cristian De Gobba等人鉴定来源于羊奶的抗氧化生物活性肽：首先，将水解物通过排阻色 谱法分级，用选定的生物活性测定方法测定每部分的活性（如：体外的抗氧化活性）；然后 将活性强的部分随后用半制备反相高效液相色谱法进一步分离，进行活性测定；最后，将分 离得到的活性最强的部分用液相色谱串联质谱分析鉴定序列。
[0003] 然而，以生物活性为主导进行分级分离的策略会在每次分离的过程中造成损失， 因而忽略了一些低浓度的活性物质。特别是，酸奶在发酵过程中产生一系列复杂多样的多 肽混合物，来源于含量不一的牛奶蛋白前体，包括a si-酪蛋白、a s2_酪蛋白、β-酪蛋白、 K-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和牛血清白蛋白，它们之间的相对含量之比大约为 30:30:10:12:10:4:1，因此采用传统方法来源于低浓度蛋白前体的多肽很难被鉴定得到。
[0004] 因此，为了得到尽可能多的生物活性物质，本文通过简单的前处理，包括超滤、固 相萃取，用模拟人体胃肠道消化实验对处理发酵乳，以保证验证得到的肽在一定程度上具 有抵制水解的能力后，不经多次分级分离，直接用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱 仪分析，以期得到更丰富、浓度相对较低的多肽物质。此外，本文还建立了一种鉴定发酵乳 及其消化产物中多肽的方法，为低浓度生物活性肽的鉴定奠定了基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种鉴别发酵乳中生物活性多肽 的方法，具体包括如下步骤：
[0006] 1)多肽的粗提：取发酵乳进行低温离心分离，取上清液；
[0007] 2)多肽的纯化：
[0008] c.对步骤1)的上清液进行超滤处理，收集滤液；
[0009] d.固相萃取柱分离：收集的滤液采用Waters Sep-pak C18固相萃取柱萃取，收集 生物活性多肽混合物；
[0010] 3)多肽的消化及稳定性：采用两步酶解法酶解步骤2)的生物活性多肽混合物，第 一步酶解所采用的酶为胃蛋白酶，第二步酶解所采用的酶为胰酶；
[0011] 4)将步骤3)得到的产物进行超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱UPLC-MS联 用分析，得到生物活性多肽的相对分子量；
[0012] 5)建立牛奶来源蛋白氨基酸序列数据库；
[0013] 6)将步骤4)中UPLC-MS分析得到的相对分子质量，在牛奶来源蛋白氨基酸序列数 据库中进行搜索，得到预测多肽序列；
[0014] 7)验证生物活性多肽的序列：将步骤6)中所得预测多肽序列的理论二级质谱图 与UPLC-MS得到的实际二级质谱图对比分析，通过二级质谱图中的离子碎片峰的匹配情 况，确认预测多肽序列是否正确。
[0015] 较优的，步骤1)所述发酵乳为瑞士乳杆菌发酵乳。
[0016] 更优的，所述瑞士乳杆菌发酵乳为将瑞士乳杆菌添加到脱脂乳中进行厌氧发酵 而获得；所述厌氧发酵的条件为：发酵温度36~38°C，发酵培养6~8h ;更优选发酵温度 37°C，发酵培养7h。
[0017] 优选的，所述瑞士乳杆菌为瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus，CICC6024)。
[0018] 本发明所述脱脂乳为经过脱脂处理的牛乳，通常脱脂乳中脂肪含量小于0. 1%。
[0019] 较优的，步骤1)中，所述低温离心的条件为：4°C，8000~lOOOOrpm，离心15~ 30min〇
[0020] 较优的，步骤2) a中，所述超滤处理所采用的是截留分子量分别为3kDa的超滤管。
[0021] 更优的，步骤2) a中，所述超滤处理过程中，转速为4800r/min，时间为30min，离心 温度为4°C。
[0022] 较优的，步骤2)b中，固相萃取柱分离，具体方法为：活化和平衡Waters Sep-pak C18固相萃取柱；将步骤3) a中收集的滤液进行稀释后上样，采用洗脱液洗脱，收集所得到 的洗脱液，即包含生物活性多肽混合物。
[0023] 较优的，步骤2)b中，固相萃取柱分离法中，所采用的洗脱液为甲醇和CldH2O的混 合液，所述甲醇和CldH 2O的混合液中甲醇与CldH2O的体积比为80:20,所述甲醇和CldH2O的混 合液中含有0.1% (v/v)的甲酸。
[0024] 较优的，步骤2)b中，固相萃取柱分离法中，采用甲醇活化Waters Sep-pak C18固 相萃取柱；优选2ml甲醇。
[0025] 较优的，步骤2)b中，固相萃取柱分离法中，采用ddH20平衡Waters Sep-pak C18 固相萃取柱；优选2mlddH20。
[0026] 较优的，步骤2)b中，固相萃取柱分离法中，将步骤3)a中收集的滤液进行稀释50 倍后上样，采用400ul洗脱液洗脱。
[0027] 较优的，步骤2)b固相萃取柱分离法中，先采用2mL甲醇活化Waters Sep-pak C18 固相萃取柱，采用2mLddH20平衡Waters Sep-pak C18固相萃取柱；上样样品为2mL;将步 骤3) a中收集的滤液稀释50倍，采用400 μ L洗脱液洗脱。
[0028] 较优的，步骤3)所述两步酶解法具体步骤为将步骤2)得到的含有多肽的混合 物溶于灭菌去离子水中，并加入胃蛋白酶，获得反应液，调节反应液pH值为1. 9~2. 1，在 36. 5~38. 5°C的恒温水浴中保温反应60~120min，获得第一步酶解液；将第一步酶解液 的pH值调整为7. 4~7. 6,并加入胰酶，于36. 5~38. 5°C的恒温水浴中保温反应120~ 180min，获得第二步酶解液；将第二步酶解液采用95~KKTC水浴法加热使酶失活，获得酶 解产物；酶解产物冷冻干燥获得产品。
[0029] 优选的，第二步酶解液采用95~100°C加热的时间为5min。
[0030] 较优的，步骤3)所述胃蛋白酶的添加量为胃蛋白酶10~30mg/g底物；所述胰酶 的添加量为胰酶30~50mg/g底物。
[0031] 更优的，步骤3)所述胃蛋白酶的添加量为胃蛋白酶20mg/g底物；所述胰酶的添加 量为胰酶40mg/g底物。
[0032] 较优的，步骤6)具体实现的方法为：将UPLC-MS得到的相对分子质量，与已建立的 牛奶来源蛋白氨基酸序列数据库中氨基酸序列对应的相对分子量匹对，得到相对分子质量 误差在±0.0 lDa内的生物活性多肽的序列、该序列的相对分子质量以及该序列的具体蛋 白来源，以此作为预测多肽序列。
[0033] 优选的，步骤7)中所得预测多肽序列的理论二级质谱图是指步骤6)中，所得预测 多肽序列的理论二级质谱图。
[0034] 进一步的，以a -SI-酪蛋白为例，来说明本发明所使用的具体的程序代码：
[0035] a)程序和数据库的选择
[0036] JAVA+MySQL
[0037] b)数据库结构
[0038]
[0039] 注意：数据库中保存的quality是氨基酸片段质量乘以10000之后的结果。c)插 入氨基酸片段的分析（以a - Sl -酪蛋白为例）
[0040] 1.代码片段 [0041 ]
[0053] 本发明第二方面公开了前述方法在生物活性多肽鉴别中的应用。
[0054] 本发明的有益效果为：
[0055] (1)采用本发明的方法，对发酵乳进行了有效的前处理后，共得到1374种低分子 量化合物，证实了经本实验室的瑞士乳杆菌发酵得到的酸奶中物质的复杂性以及质谱检测 器优越的灵敏度和分离性。
[0056] (2)本发明在UPLC-MS分析前，对发酵乳进行胃肠道消化模拟实验，因此最终得到 的多肽序列对消化酶有良好的耐受性，在一定程度上能抵抗其水解作用。
[0057] (3)本发明对发酵乳进行了有效的前处理后，进行胃肠道消化模拟实验，保证尽可 能多的得到消化产物中的多肽，特别是浓度低的多肽，并且得到的多肽序列一定程度上具 有抵抗水解的作用，更利于人体吸收并发挥其生物活性。同时，还建立了一种通过分子量匹 配得到预测序列，再通过计算验证预测多肽序列的方法。通过这种方法鉴定得到牛奶蛋白 来源多肽共119条，除已经被报道过的生物活性肽外，还得到了大量未被前人报道过的多 肽。该方法能普遍用于复杂基质中生物活性肽的分析鉴定，比如发酵乳。
【附图说明】
[0058] 图1 :发酵乳消化产物质量色谱图
[0059] 图2 :质荷比为615. 37Da的质量色谱图及一级质谱图
[0060] 图3 :质荷比为615. 37Da的片段的二级质谱匹对图
[0061] 图4 :质荷比为615. 37Da的预测多肽az，by断裂情况
[0062] 图5 :质荷比为544. 38Da的质量色谱图及一级质谱图
[0063] 图6 :质荷比为615. 37Da的片段的二级质谱匹对图
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