基于荧光微球免疫层析法检测t-2毒素的产品及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品安全检测领域,涉及一种基于荧光微球免疫层析法检测T-2毒素的产品及其制备方法。
【背景技术】
[0002]T-2毒素是由多种镰刀菌(三线镰刀菌为主)产生的一种A类单端孢霉烯族倍半萜烯类霉菌毒素。该毒素广泛污染小麦、大麦、玉米等谷物及其制品,可通过食物链的富集作用和体内蓄积作用,最终对动物和人类健康造成潜在威胁。文献显示,T-2毒素已在全球范围内广泛出现,在我国谷物中的检出率达80%。T-2毒素具有较强的毒性,研究表明,其毒素能够引起人和动物多个系统的毒性效应。包括抑制蛋白质、DNAjP RNA的合成,诱导细胞凋亡,引起白细胞减少,造成血液毒性和免疫损伤等。人畜误食被大量毒素污染的谷物或饲料后,会引发多种急慢性中毒。表现为,呕吐、腹泻食道病变、造血组织严重损伤、神经机能障碍和免疫抑制等。目前,已有多个国家制定了 T-2毒素的残留限量标准。在我国,由于监测标准的缺乏,国内未能形成健全的T-2毒素安全性评价方案,仅有GB21693-2008《配合饲料中T-2毒素的允许量》中规定猪配合饲料和禽配合饲料中T-2毒素的允许量< Img/
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[0003]国内外有关T-2的检测方法有液相色谱法、气相色谱法和色谱联用法等仪器分析方法。这类仪器分析方法准确、稳定、灵敏,但耗时、设备昂贵,前处理方法繁琐,需要专业人员操作,不适用实际生产生活中。此外,快捷简便且灵敏的免疫检测技术是目前市场上应用最广泛的,主要有酶联免疫吸附法、免疫层析法等。相比较而言,免疫层析方法简单快速,结果直观,且不需要专业分析人员,特别适合现场监测。
[0004]荧光微球是指将荧光团通过包埋、共价键连接等方式引入有机或无机纳米粒子中,并让纳米粒子承担有机小分子焚光染料的检测、标记等功能,具有相对稳定的形态结构以及发光行为。在荧光染料标记技术的基础上,建立起荧光微球标记层析检测技术,兼具ELISA和胶体金试纸条的快速、稳定、操作简便等优点。同时与胶体金免疫层析技术相比,又具有其自身优点:(1)而荧光微球层析技术由于使用的示踪物为荧光微球,在激发光的照射下存在一个信号放大的过程,所以其灵敏度较胶体金试纸条要高;(3)荧光微球检测试纸条能够通过荧光读数仪进行定量检测,能够有效提高免疫层析检测的灵敏度。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一种基于荧光微球免疫层析法检测T-2毒素的产品。
[0006]本发明所提供的基于荧光微球免疫层析法检测T-2毒素的产品,可为如下ASB:
[0007]A、由试纸条和经荧光微球标记的T-2毒素抗体组成;
[0008]所述试纸条由依次连接并固定于底板上的样品垫、设有检测线和质控线的层析膜,以及吸水垫组成;
[0009]所述检测线和所述质控线相互分离;
[0010]所述检测线处包被有T-2毒素半抗原与载体蛋白的偶联物;
[0011]所述质控线处包被有二抗,所述二抗为抗所述经荧光微球标记的T-2毒素抗体的抗体;
[0012]所述检测线位于所述层析膜靠近所述样品垫的一端;
[0013]所述质控线位于所述层析膜靠近所述吸水垫的一端;
[0014]B、由含有A中所述试纸条的试剂盒和所述经荧光微球标记的T-2毒素抗体组成;
[0015]所述试剂盒由所述试纸条和与所述试纸条扣合且符合如下条件的盖板组成:所述盖板上具有与所述样品垫对应的加样窗口,以及与所述检测线和所述质控线对应的显示窗
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[0016]在所述产品中,“所述T-2毒素与载体蛋白的偶联物”中的“所述T-2毒素半抗原”具体可为3-琥?白酰-T-2 ;“所述载体蛋白”具体可为卵清蛋白(ovalbumin, OVA)。
[0017]在本发明中,由3-琥?白酰-T-2和卵清蛋白(ovalbumin, OVA)形成偶联物的偶联比为10.8:1 (卵清蛋白:3_琥珀酰-T-2的物质的量比)。
[0018]该偶联物具体是按照包括如下步骤的方法制备获得的:
[0019]a)按照如下制备半抗原3-琥珀酰-T-2 (3-HS-T-2):al)将T_2毒素溶于吡啶,加入琥珀酸酐并置于沸水浴中搅拌反应4h,后蒸干吡啶;其中,所述T-2毒素、所述吡啶和所述琥泊酸酐的配比为1mg:0.4mL:210mg ;a2)向步骤al)的残渣中加入氯仿复溶,再用去离子水洗涤,去除杂质,保留氯仿层,洗涤过程重复4次;其中,所述氯仿的用量与步骤al)中所述T-2毒素的用量配比为5mL:10mg ;a3)将步骤a2)中的溶液蒸干,即得所述半抗原
3-琥珀酰-T-2。
[0020]b)按照如下制备包被原(3-HS-T-2-0VA):bl)向步骤a)制备的所述半抗原3_琥珀酰-T-2中加入DMF,震荡溶解,得到A液;其中,所述DMF的用量与步骤al)中所述T-2毒素的用量配比为ImL: 1mg ;将卵清蛋白(OVA)和1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)溶于磷酸盐缓冲液中,得到B液;其中,所述卵清蛋白(0VA)、所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)_碳二亚胺(H)C)和所述磷酸盐缓冲液的配比为25mg:15mg:5mL ;所述磷酸盐缓冲液的溶剂为水,溶质及浓度如下=KH2PO40.27g/L,Na2HPO4.12H20 2.86g/L,KCl 0.2g/L,NaCl 8.8g/L ;b2)将所述A液和所述B液混匀,室温(20-25°C )搅拌过夜(12_16h) ;b3)将步骤2)的反应液装入半透膜中,在所述磷酸盐缓冲液中透析3天,每天更换3次透析液,获得所述包被原。
[0021]当然所述卵清蛋白可以替换为其他载体蛋白,只要确保所述偶联物具有对T-2毒素的抗原性即可。
[0022]在所述产品中,所述荧光微球标记的T-2毒素抗体为将待标记的T-2毒素抗体和所述荧光微球以酰胺键共价结合形成的聚合体。
[0023]其中,所述荧光微球为表面修饰有羧基官能团,内部包埋有荧光物质的纳米粒子,直径为200nm,其变异系数为5% ;所述荧光微球的最大激发和发射波长分别为580nm和605nmo
[0024]在本发明的一个实施例中,所述荧光微球具体是以含有所述荧光微球的悬浊液的形式呈现的,其固体含量为2%,即每ImL所述悬浊液中含有所述荧光微球0.02g,余量为超纯水。更加具体的,所述焚光微球为Thermo Fisher Scientific Inc.产品,其产品目录号为 F-8887。
[0025]所述T-2毒素抗体既可为T-2毒素单克隆抗体也可为T-2毒素多克隆抗体。在本发明的一个实施例中,所述T-2毒素抗体为T-2毒素单克隆抗体,具体为鼠源T-2毒素单克隆抗体,具体为北京维德维康生物技术有限公司产品,其产品目录号为T-2-3D1-F1。相应的,所述二抗为抗鼠IgG的抗体,具体为羊抗鼠IgG的多克隆抗体,具体为北京维德维康生物技术有限公司产品。
[0026]所述经荧光微球标记的T-2毒素抗体按照包括如下步骤的方法制备:将所述T-2毒素抗体和所述荧光微球以6 μ g:20 μ L (相当于0.4mg荧光微球)的比例进行反应得到以酰胺键共价结合形成的荧光微球与T-2毒素抗体的偶联物。
[0027]在所述经荧光微球标记的T-2毒素抗体的制备方法中,所述反应具体为:将所述T-2毒素抗体和所述荧光微球以6 μ g:20 μ L(相当于0.4mg荧光微球)的比例加入到标记缓冲液中,室温(20-25°C )避光振荡15min ;加入偶联活化剂1_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC),室温(20-25°C )避光振荡反应2h ;接着加入牛血清白蛋白溶液室温(20-25°C )避光振荡15min ;离心,所得沉淀用复溶液复溶;再离心,所得沉淀中即含有所述经荧光微球标记的T-2毒素抗体。
[0028]所述标记缓冲液的pH值为6.5,溶质为吗啉乙磺酸,溶剂为水;所述吗啉乙磺酸在所述标记缓冲液中的浓度为0.05M。
[0029]所述牛血清白蛋白溶液的溶剂为水,溶质为牛血清白蛋白;所述牛血清白蛋白在所述牛血清白蛋白溶液10mL中的含量为20g。
[0030]所述复溶液的溶剂为0.02M磷酸缓冲液,溶质为牛血清白蛋白、葡聚糖(Dextran40000)和聚乙二醇(PEG 20000);所述牛血清白蛋白在所述复溶液中的浓度为10g/L,所述Dextran 40000在所述复溶液中的浓度为20g/L,所述PEG 20000在所述复溶液中的浓度为lg/L。所述0.02M磷酸缓冲液的组成如下??每IL所述0.02M磷酸缓冲液中含有 Na2HPO4.12H20 5.37g,NaH2PO4.2H20 0.78g,余量为水。
[0031]其中,所述T-2毒素抗体与所述标记缓冲液的使用配比为6 μ g =ImL0所述偶联活化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)用量为0.4mg/20yL所述荧光微球(相当于0.4mg荧光微球)。所述牛血清白蛋白溶液的用量为20 μ L/20 μ L所述荧光微球(相当于0.4mg焚光微球)。所述离心的转速为12857g,时间为lOmin。所述离心的次数为2次。
[0032]在本发明的一个实施例中,具体是按照包括如下步骤的方法制备获得所述经荧光微球标记的T-2毒素抗体的:将6 μ g所述T-2毒素抗体和20 μ L所述荧光微球(固体含量为2%,相当于0.4mg荧光微球)加入到所述标记缓冲液中,室温(20-25°C )避光振荡15min ;加入0.4mg偶联活化剂1-乙基_(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC),室温(20-250C )避光振荡反应2h ;接着加入20 μ L所述牛血清白蛋白溶液,室温(20_25°C )避光振荡15min ;12857g离心lOmin,所得沉淀用所述复溶液复溶;再12857g离心lOmin,所得沉淀中即含有所述经荧光微球标记的T-2毒素抗体。
[0033]在本发明中,所述样品垫的材质为聚酯纤维膜;所述层析膜的材质为硝酸纤维素膜;所述吸水垫的材质为植物纤维吸滤纸;所述底板的材质为PVC胶粘板。
[0034]上述基于荧光微球免疫层析法检测T-2毒素的产品可按照如下所述方法制备。
[0035]本发明所提供的基于荧光微球免疫层析法检测T-2