一种快速鉴别细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鉴别细胞的方法，具体地说，涉及一种建立细胞无机、有机指纹谱库并利用无机、有机指纹谱库快速鉴别细胞的方法，属于检验技术领域。
【背景技术】
[0002]目前鉴别细胞的方法主要有形态学鉴别、细胞表面标志物鉴别、细胞因子鉴别、基因鉴别、蛋白鉴别等。其中形态学鉴定细胞是一种最基本的方法，这种方法通过显微镜等工具观察细胞形态上的差别，比较方便快捷，但是，细胞生长特性和生长环境等因素影响着细胞形态的变化，因此，仅靠形态学鉴定目标细胞不是一种可靠的鉴定方法，需要结合其他多种方法才能准确高效地鉴别出细胞差异。
[0003]细胞表面标志物、细胞因子、基因鉴别和蛋白鉴别等需要进行免疫学鉴定，这些检测方法费时费力；并且只凭借一种方法很难准确鉴别出细胞，准确性低；需要综合多方面的检测结果才能进行确证，造成检测成本比较高。
[0004]以上细胞的鉴定方法均属于生物手段，目前还没有利用物理手段进行快速鉴定细胞的报道。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是针对以上存在的不足和缺陷，提供一种快速鉴别细胞的方法，采用该方法，具有检测成本低、检测时间短、准确性高的优点。
[0006]为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案:一种快速鉴别细胞的方法，其特征在于，所述方法包括先建立细胞无机、有机指纹谱库；采集待测细胞的无机、有机指纹谱，然后与细胞无机、有机指纹谱库中已知细胞的指纹质谱数据进行匹配，来判断是否为同一种类细胞。
[0007]—种优化方案，所述指纹质谱数据指有机指纹谱中特征蛋白的分子量、特征蛋白的数量以及无机指纹谱中各种重金属元素的含量。
[0008]进一步地，当待测细胞的无机、有机指纹谱与细胞无机、有机指纹谱库中已知细胞的指纹质谱数据相似度达到90%以上时，即可判断为同一种类细胞。
[0009]进一步地，建立细胞无机、有机指纹谱库包括:
收集细胞步骤、预处理步骤、采集ICP-MS数据并建立无机指纹谱步骤、采集MALD1-T0F-MS数据并建立有机指纹谱步骤。
[0010]进一步地，收集细胞样品步骤包括:
细胞在培养箱内以37°c培养24h，收集2 X 16数量级的细胞，1600rpm在5°C下离心5min，弃去上清液，每种细胞都平行培养6次。
[0011]进一步地，预处理步骤包括:
a) ICP-MS样品预处理:将离心收集的50%细胞用纯净水洗涤三次，转移于聚四氟乙烯消解罐中，加入质量百分比浓度65%的0.5mL硝酸及质量百分比浓度30%的0.1mL过氧化氢放置过夜；
消解罐放入微波消解仪中进行消解，消解完毕开盖，摇匀备用。
[0012]b)MALD1-TOF-MS样品预处理:将离心收集的另50%细胞直接加入浓度为10mg/mL的10PL肉桂酸(CHCA)、芥子酸(SA)或2，5_ 二羟基苯甲酸(DHB)基质溶液中的一种中，在细胞超声破碎仪上粉碎1-2分钟，在1600rpm离心，弃去上清液，将以上步骤重复一次，再加入ΙΟΟμ?基质溶液溶解之后滴于靶板之上。
[0013]进一步地，采集ICP-MS数据包括:
ICP-MS的工作条件:功率:1550W ;采样深度:8mm ;载气流速:1.07L/min ;定量分析模式，单位质量数采集点数为3，数据采集重负次数为3次，积分时间As为Isec ;Se、Cd为2sec ;其他元素为0.3sec ;在线内标:Li6、Sc、Ge、Y、In、Tb、Bi=L 0mg/L多元素混合内标；其中Ge (72)作为质量数23 — 82各元素内标；In(115)作为质量数114 一 137各元素内标；Bi (209)作为质量数202 - 238各元素内标；
建立无机指纹谱包括:通过ICP-MS工作软件对数据进行处理，每种细胞连续进样6次考察其精密度，同一细胞平行制备6次并上机考察其重现性，并在不同的细胞培养时间0h，lh，3h，5h, 19h进行检测考察结果的稳定性，最后收集待测细胞中各种重金属元素浓度数据并经过归一化处理后绘制指纹谱图；使用统计学软件对不同细胞进行统计学差异分析。
[0014]进一步地，采集MALD1-T0F-MS数据包括:
MALD1-TOF-MS的工作条件:氮气激光光源，激光波长377nm，线性正离子操作模式，加速电压20kv，设定质量范围4800-30000m/z，激光发射电压2500mv，激光频率50Hz ；
建立有机指纹谱包括:用MALD1-T0F-MS对细胞进行分子量0-50000 Da范围内的全扫描，每种细胞连续进样6次考察其精密度，同一细胞平行制备6次并上机考察其重现性，并在不同的细胞培养时间0h，lh，3h，5h, 19h进行检测考察结果的稳定性；
应用Protein Chip和B1marker Wizard软件对细胞有机指纹图谱进行分析，标记出建模细胞的共有蛋白峰；
对每种细菌每个共有蛋白峰分子量求均值，标准差及变异系数，共有蛋白峰分子量变异系数< 0.5%，以相似度为指标，采用类间平均链锁法，利用欧式距离平方测量技术，将所得数据输入spss软件进行聚类分析。
[0015]进一步地，未知细胞经收集细胞步骤、预处理步骤、采集ICP-MS数据并建立无机指纹谱步骤、采集MALD1-T0F-MS数据并建立有机指纹谱步骤后得到其无机指纹谱和有机指纹谱，分别导入相应的无机和有机指纹谱库，可得到有机谱库的聚类分析结果以及无机谱库的差异性分析结果。
[0016]进一步地，包括权利要求5-8任一项的方法。
[0017]本发明采用以上技术方案后，与现有技术相比，具有以下优点:将细胞进行简单的预处理之后就可以直接上机实现自动化检测，两种仪器对于每个细胞的检测时间都小于5分钟，检测成本比较低，检测速度快。通过有机和无机质谱的交叉验证，对细胞鉴别有着较高的准确性，达到90% ;对同一份样品制备液连续进样6次；对同一样品制备5份进行检测对比；对同一样品制备液依次在0h，4h, 8h, 12h, 24h, 48h进样6次，然后得到的数据导入计算软件，以相似度为指标，采用类间平均链锁法，利用欧式距离平方测量技术，通过spss统计软件进行聚类分析，具有良好的精密度、重现性和稳定性。
[0018]下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。
【附图说明】
[0019]附图1是本发明实施例中几种细胞的无机元素指纹分布图；
附图2是本发明实施例中一种细胞在不同时间的有机指纹谱图；
附图3是本发明实施例中有机谱库的聚类分析结果；
附图4是本发明实施例中无机谱库的差异性分析结果。
【具体实施方式】
[0020]下面以人乳腺癌细胞Hela为例进行说明建立细胞无机、有机指纹谱库的方法，该方法是一种通用方法，不局限于Hela细胞；是为了便于理解本发明，而不以任何方式限制本发明的权利要求和核心内容。
[0021]实施例，一种快速鉴别细胞的方法，包括先建立细胞无机、有机指纹谱库；采集待测细胞的无机、有机指纹谱，然后与细胞无机、有机指纹谱库中已知细胞的指纹质谱数据进行匹配，来判断是否为同一种类细胞。
[0022]其中，指纹质谱数据指有机指纹谱中特征蛋白的分子量、特征蛋白的数量以及无机指纹谱中各种重金属元素的含量。
[0023]当两者指纹质谱数据与细胞指纹质谱数据的相似度达到85%以上时，即可判断为同一种类细胞。
[0024]具体地说，建立细胞无机、有机指纹谱库包括:收集细胞步骤、预处理步骤、采集ICP-MS数据并建立无机指纹谱步骤、采集MALD1-T0F-MS数据并建立有机指纹谱步骤。
[0025]收集细胞样品步骤:
人乳腺癌细胞Hela在培养箱内以37°C培养24h，收集2 X 16数量级的细胞，1600rpm在5°C下离心5min，弃去上清液，每种细胞都平行培养6次。
[0026]预处理步骤:
a) ICP-MS样品预处理:将离心收集的50%细胞用纯净水洗涤三次，转移于聚四氟乙烯消解罐中，加入质量百分比浓度65%的0.5mL硝酸及质量百分比浓度30%的0.1mL过氧化氢放置过夜；
消解罐放入微波消解仪中进行消解，消解完毕开盖，摇匀备用。
[0027]b)MALD1-TOF-MS样品预处理:将离心收集的另50%细胞直接加入浓度为10mg/mL的10PL肉桂酸(CHCA)、芥子酸(SA)或2，5_ 二羟基苯甲酸(DHB)基质溶液中的一种中，在细胞超声破碎仪上粉碎1-2分钟，在1600rpm离心，弃去上清液，将以上步骤重复一次，再加入ΙΟΟμ?基质溶液溶解之后滴于靶板之上。
[0028]采集ICP-MS 数据:
ICP-MS的工作条件:功率:1550W ;采样深度:8mm ;载气流速:1.07L/