层叠的转基因蛋白质的多重分析的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是2010年6月3日提交的申请号2010800224557. 9(PCT申请号PCT/ US2010/037192)、发明名称为"层叠的转基因蛋白质的多重分析"的发明专利申请的分案申 请。
[0002] 本申请要求于2009年6月3日在美国专利商标局提交的临时申请系列号 61/183, 777的优先权，将其通过提述并入本文。
技术领域
[0003] 本发明一般性涉及植物性状的高通量分析。在某些实施方案中，本发明涉及高通 量分析的方法和通过用单次注入来源于植物和植物组织的复杂蛋白样品的质谱法确定植 物蛋白的量。某些实施方案进一步涉及分析转基因植物的基因型以及在那些具有所需植物 性状的植物中维持表达的方法。
【背景技术】
[0004] 正在增加的使用重组DNA技术以产生供商业和产业用途的转基因植物需要开 发高通量的分析转基因植物品系的方法。需要此类方法在后续世代中维持转基因植物 品种，防止转基因逃逸至环境中，和协助快速开发具有所需或优化表型的转基因植物。 而且，目前对于提出供人类消费的GM植物的安全性评估的指南需要在亲本和转化的作 物之间在DNA和蛋白质水平的表征。Sesikeran和\%3&111:11；[(2008)48丨3?&(3.]\(]1;[11· Nutr. 17Suppl. 1:241-44。开发的新植物品种包含越来越复杂的遗传修饰，包括但不限于层 置的（stacked)基因和性状。
[0005] 本领域优选的供分析转基因植物的现行方法为：基于DNA的技术（例如PCR); RT-PCR;报道基因的使用；Southern印迹法；和免疫化学。所有这些方法遭受多种不利之 处，需要可广泛地从来自转基因植物的有限样品以高通量方式快速和廉价地鉴定并量化多 重转基因基因产物的优秀方法。
[0006] 供转基因植物分析的基于DNA的技术遭受几种明显的缺陷。尽管土壤杆菌 (Agrobacterium)介导的转化是最优选的遗传植物转化方法的事实，土壤杆菌转化的 植物的基因型难以通过基于PCR的方法分析。参见Nain等（2005)PlantMol.Biol-itep. 23:59-65。 转化组织中甚至痕量的土壤杆菌的存在导致误导性PCR结果。见上 文。DNA扩增形式还需要基因特异性引物和热循环仪条件的经验性测试。最重要的是， 供筛选转基因植物的基于DNA的方法实际上没有确定基因产物蛋白的表达。类似地， RT-PCR或Northern印迹分析可用于确证转基因转录物在转基因植物材料中的存在。 Alwine等（1977)Proc.Nat.Acad.Sci. 74:5350-54;Toplak等（2004)PlantMol.Biol. R印.22:237-50。这些方法均无法确证来源植物材料中存在实际的蛋白表达。这些技术还 需要使用放射性材料和/或大量组织和处理时间。
[0007] 报道基因，如编码荧光蛋白的基因，亦可共转化入转基因植物以提供鉴定转化体 的工具。然而，报道基因仅为遗传重组的间接报道者。报道基因构建体的表达没有确证相 伴的转基因的表达。此外，报道基因或转基因之任一可在宿主植物的后续世代中丧失，由此 使得报道子的存在和目标转基因的偶联解除。类似地，转基因可从宿主植物逃逸至邻近植 物，例如通过异花授粉，而报道基因并不随之逃逸。当多重基因层叠于转基因植物中时，必 须导入相同数量的报道基因以分析转基因蛋白质组，且因为报道基因功能仅为转基因功能 的间接报道子，无法检测出一种转基因的表达响应于其他转基因的存在的改变。
[0008] 与上文概述的方法不同，免疫化学可用于在转基因植物中鉴定转基因表达的产 物。尽管免疫化学可用于该目的，该方法需要高度纯化的蛋白质样品以供抗体产生。必须就 特异性测试所得的抗体，且必须开发试剂特异性测定条件。进行免疫化学所需的表达和纯 化的高水平，以及相关的从植物组织去除污染物的问题，限制该方法的有用性（utility)。
[0009] 质谱法亦可用于分析转基因植物的蛋白质组。然而，本领域通行的质 谱技术需要植物蛋白的复杂混合物首先通过二维凝胶电泳分离。Rajagopal和 Ahern(2001)Science294(5551):2571-73;亦参见Domon和Aebersold(2006)Science 312(5771) :212-17, 214。然后可用蛋白酶消化来自凝胶分离的蛋白样品的单个条带并对其 进行质谱法以鉴定最初存在于未消化条带中的独特蛋白。参见例如Chang等（2000)Plant Physiol. 122(2) :295-317。该方法中的凝胶分离步骤是耗费时间的工艺，其妨碍质谱法在 高通量应用中的使用。
[0010] 本领域需要供检测和量化植物中转基因表达产物存在的高通量方法，所述方法无 需纯化的或高度表达的蛋白质，或方法特异性的试剂。该方法对于帮助转基因植物的培养 者（cultivator)和栽培者（grower)在有性和/或无性繁殖的后续世代中维持目标转基因 植物品种的基因型会是有用的。该方法对于迅速分析转化方法所得的植物以鉴定为转基因 植物并在所需组织中表达导入蛋白的那些所得的植物亦会是有用的。此外，本方法可用于 迅速筛选有受来自转基因植物的转基因污染的风险的植物，从而实现转基因植物的生物限 制（bioconfinement)〇
【发明内容】
[0011] 本发明的一个具体实施方案包括在基于植物的样品中检测并量化两种或更多种 具有已知氨基酸序列的目标蛋白的存在的高通量方法。该方法包括包含蛋白质的复杂的基 于植物的样品的第一注入，并将该复杂的基于植物的样品蛋白质消化为肽。或者，该方法包 括预备步骤，其中将所述复杂的基于植物的样品蛋白质消化为肽，接着提供该肽的第一注 入。然后将肽分离并电离。对于所述肽获得了同时质谱数据（simultaneousmassspectral data)，并确定所述两种或更多种目标蛋白的存在与否。
[0012] 本发明的另一个实施方案包括在基于植物的样品中检测两种或更多种具有已知 氨基酸序列的目标蛋白质的存在的高通量方法。该方法包括对于两种或更多种目标蛋白提 供质谱数据，并提供包含蛋白质的复杂的基于植物的样品的第一注入。将该复杂的基于植 物的样品蛋白质消化为肽，然后将所述肽分离并电离。对于所述肽获得同时质谱数据。将 该同时质谱数据与对于所述两种或更多种目标蛋白给出的质谱数据相比较，由此确定所述 两种或更多种目标蛋白的存在与否。
[0013] 本发明的另一种实施方案包括维持转基因植物品种的基因型的方法。该方法 包括：（i)对于所述转基因植物品种中转基因表达的一种或多种预期产物提供质谱数据； (ii)提供复杂样品的第一注入，所述样品包含来自所述转基因植物品种的第一世代的蛋白 质；（iii)将所述复杂的基于植物的样品蛋白质消化为肽；（iv)分离所述肽；(V)电离所述 肽；(Vi)对于所述肽获得同时质谱数据，并将该同时质谱数据与对于转基因表达的所述预 期产物给出的质谱数据相比较，由此确定转基因表达的所述预期产物在所述转基因植物品 种的第一世代中存在与否；(Vii)提供复杂样品的第一注入，所述样品包含来自所述转基 因植物品种的第二世代的蛋白质；(Viii)用包含来自所述转基因植物品种的第二世代的 蛋白质的复杂样品重复步骤（iii)-(vi);和（ix)若在对于来自所述转基因植物品种的第 二世代的复杂蛋白质样品所得的肽的质谱数据中无法确证转基因表达的预期产物的存在， 则无法繁殖所述转基因植物品种的第二世代，由此维持所述转基因植物品种的基因型。
[0014] 具体而言，本公开提供下列各项：
[0015] 1. -种在基于植物的样品中检测两种或更多种具有已知氨基酸序列的目标蛋白 质的存在的高通量方法，该方法包括：
[0016] (i)提供通过消化基于植物的样品蛋白质获得的肽；
[0017] (ii)分离所述肽；
[0018] (iii)电离所述肽；和
[0019] (iv)对于所述肽获得同时质谱数据，并确定所述两种或更多种目标蛋白质存在与 否。
[0020] 2.项1的方法，其中步骤（ii)中分离的肽是通过柱层析分离的。
[0021] 3.项1的方法，其中所述柱层析为液相柱层析。
[0022] 4.项1的方法，其中步骤⑴中消化的蛋白质是在注入之前的单一步骤中消化的。
[0023] 5.项1的方法，其中步骤（ii)中分离的肽是在单一步骤中分离的。
[0024] 6.项1的方法，其中步骤（iii)中电离的肽是在单一步骤中电离的。
[0025] 7.项1的方法，其中对于对应于两种或更多种目标蛋白质的肽的同时质荷比数据 是在单一步骤中获得的。
[0026] 8.项1的方法，其中所述两种或更多种目标蛋白质是两种目标蛋白质。
[0027] 9.项1的方法，其中所述两种或更多种目标蛋白质是四种目标蛋白质。
[0028] 10.项1的方法，其中所述基于植物的样品来自转基因植物。
[0029] 11.项1的方法，其中基于植物的样品来自转基因植物，且所述两种或更多种目标 蛋白质为该转基因植物中转基因表达的预期产物。
[0030] 12. -种在基于植物的样品中检测两种或更多种具有已知氨基酸序列的目标蛋白 质的存在的高通量方法，该方法包括：
[0031] (i)对于两种或更多种目标蛋白质提供质谱数据；
[0032] (ii)提供包含蛋白质的复杂的基于植物的样品的第一注入；
[0033] (iii)将所述复杂的基于植物的样品蛋白质消化为肽；
[0034] (iv)分离所述肽；
[0035] (v)电离所述肽；
[0036] (vi)对于所述肽获得同时质谱数据，和
[0037] (vii)将该同时质谱数据与对于所述两种或更多种目标蛋白质提供的质谱数据相 比较，由此确定所述两种或更多种目标蛋白质的存在与否。
[0038] 13.项12的方法，其中步骤（iii)中消化的蛋白质是在单一步骤中消化的。
[0039] 14.项12的方法，其中步骤（iv)中分离的肽是在单一步骤中分离的。
[0040] 15.项12的方法，其中步骤（v)中电离的肽是在单一步骤中电离的。
[0041] 16.项12的方法，其中所述基于植物的样品来自转基因植物。
[0042]17. -种维持转基因植物品种的基因型的方法，该方法包括：
[0043] (i)对于转基因植物品种中转基因表达的一种或多种预期产物提供质谱数据；
[0044] (ii)提供复杂样品的第一注入，所述样品包含来自所述转基因植物品种的第一世 代的蛋白质；
[0045] (iii)将所述复杂的基于植物的样品蛋白质消化为肽；
[0046] (iv)分离所述肽；
[0047] (V)电离所述肽；
[0048] (vi)对