检测发酵乳中黄曲霉毒素b1和m1含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品检测领域。具体地，本发明涉及检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml 含量的方法。更具体地，本发明涉及检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的预处理方法 和检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的方法。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉毒素主要是由黄曲霉寄生曲霉产生的次生代谢产物，主要有B1、B1、G1、G2、 Ml以及M2。黄曲霉毒素存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污染花生、玉米、稻 米、大豆、小麦等粮油产品，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌 毒素。
[0003] 然而，目前检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的方法仍有待改进。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提供一种检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的预处理方法和一种检测发酵乳中黄 曲霉毒素B1和Ml含量的方法。该方法操作简便、快速、回收率高或者灵敏度高。
[0005] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0006] GB5413. 37-2010《乳与乳制品中黄曲霉毒素毒素Ml的检测方法》中对乳、奶粉、酸 奶、奶酪、奶油都有相应的检测方法，此方法都是通过直接离心得到上清液，并将上清液通 过免疫亲和柱。但是对于粘稠度较大、稳定性较高或者颗粒度较大的液体，不能直接通过免 疫亲和柱。
[0007] 本发明的发明人经过大量实验发现，预先利用甲醇-乙腈提取液对待测发酵乳进 行提取处理，然后将提取得到的提取液浓缩，并用缓冲液定容，随后使定容得到的混合液通 过黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，得到洗脱液，最后利用液相色谱-质谱法对洗脱液进行检 测。由此，本发明检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的预处理方法和检测发酵乳中黄 曲霉毒素B1和Ml含量的方法具有下列优点的至少之一：操作简便、快速、回收率高和灵敏 度高。
[0008] 在本发明的第一方面，本发明提出一种检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的 预处理方法。根据本发明的实施例，该方法包括：（1)将所述发酵乳与提取液进行混合，其 中，所述提取液包括乙腈和甲醇，所述乙腈体积不小于甲醇体积；⑵将步骤⑴所得到的 混合物进行离心处理，并收集上清液；（3)将所述上清液进行浓缩处理，并利用缓冲液将所 述浓缩处理的产物进行定容，以便得到待净化溶液；(4)利用免疫亲和柱对所述待净化溶 液进行净化处理，得到洗脱液；以及（5)将所述洗脱液进行浓缩处理，并用乙腈-水溶液进 行定容，以便得到待测液。发明人发现，利用乙腈-甲醇溶液能够有效地提取出发酵乳中的 黄曲霉毒素，此外，利用缓冲液将浓缩处理产物进行定容，同时可以中和发酵乳的酸，使其 酸性能够在亲和柱的承受范围内，防止过酸的发酵乳破坏亲和柱的亲和能力。由此，根据本 发明实施例的检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的预处理方法具有下列优点的至少之 一：操作简便、快速、回收率高和灵敏度高。
[0009] 根据本发明的实施例，上述检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的预处理方法 还可以具有下列附加技术特征：
[0010] 根据本发明的实施例，所述乙腈和甲醇的体积比为8:2,基于1克所述发酵乳，所 述提取液的添加量为2~3毫升。由此，根据本发明实施例的检测发酵乳中黄曲霉毒素B1 和Ml含量的预处理方法具有较简便、快速的操作，较高的回收率或者较高的灵敏度。
[0011] 根据本发明的实施例，所述净化处理包括：将所述待净化溶液通过免疫亲和柱，弃 流出液，然后用水淋洗免疫亲和柱，弃流出液，再用乙腈洗脱免疫亲和柱，得到洗脱液。由 此，根据本发明实施例的检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的预处理方法具有较简便、 快速的操作，较高的回收率或者较高的灵敏度。
[0012] 根据本发明的实施例，所述缓冲液的pH值为7. 4~8. 5。由此，根据本发明实施例 的检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的预处理方法具有较简便、快速的操作，较高的回 收率或者较高的灵敏度。
[0013] 根据本发明的实施例，在所述乙腈水溶液中，乙腈和水的体积比为1:9。根据本发 明实施例的检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的预处理方法具有较简便、快速的操作， 较高的回收率或者较高的灵敏度。
[0014] 在本发明的第二方面，本发明提出一种检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的 方法。根据本发明的实施例，该方法包括：（1)利用前面描述的预处理方法对发酵乳进行预 处理；以及（2)采用液相色谱-质谱联用法对步骤（1)所得到的混合物进行检测，并基于检 测结果确定所述发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml的含量。由此，根据本发明实施例的检测发 酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的方法具有下列优点的至少之一：操作简便、快速、回收率 高和灵敏度高。
[0015] 根据本发明的实施例，上述检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的方法还可以 进一步具有下列附加技术特征：
[0016] 根据本发明的实施例，所述质谱的检测条件包括：电离方式为电喷雾电离，正离 子；毛细管电压为3. 5kV ;锥孔电压为40V ;离子源温度为120°C;锥孔反吹气流量为50L/h ; 脱溶剂气温度为350°C;脱溶剂气流量为500L/h ;电子倍增电压为650V ;扫描方式为多离子 反应监测；针对黄曲霉毒素M1，离子选择参数包括：母离子312. 9,子离子240. 7和284. 6， 碰撞能量是38和22,驻留时间是0. 05min ;针对黄曲霉毒素B1，离子选择参数包括：母离子 329. 1，子离子259和273,碰撞能量是25和25,驻留时间是0. lmin。由此，根据本发明实施 例的检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的方法可以进一步具有较简便、快速的操作简 便、较高的回收率或者较高的灵敏度。
[0017] 根据本发明的实施例，所述液相色谱的检测条件包括：流动相流动速度：0. 3mL/ min ;色谱柱柱温：40°C ;试液温度：20°C ;进样体积：10 yL ;流动相：A相，0. 1%甲酸溶液；B 相，乙腈溶液。由此，根据本发明实施例的检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的方法可 以进一步具有较简便、快速的操作简便、较高的回收率或者较高的灵敏度。
[0018] 本领域技术人员能够理解的是，前面针对检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量 的预处理方法的特征和优点同样适用于该检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的方法， 在此不再赘述。
[0019] 在本发明的第三方面，本发明提出一种检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的 方法。根据本发明的实施例，该方法包括：（1)称取调制乳样品l〇g于50mL离心管中，加入 25毫升提取液（乙腈和甲醇按体积比8:2)，得到混合液，将所述混合液高速振荡2min，并 将得到的液体在5000转/分钟下离心5分钟，收集上清液；（2)将所述上清液在45-48摄 氏度下旋转蒸发到体积5升，再用磷酸二氢钠缓冲液（pH值为7. 4~8. 5)定容到50毫升 并混匀，得到待净化溶液，然后将待净化溶液以2mL/min~3mL/min的流速通过黄曲霉毒素 总量免疫亲和柱，弃流出液，然后用10毫升水以2mL/min~3mL/min的速度淋洗黄曲霉毒 素总量免疫亲和柱，弃流出液，再用6毫升乙腈以2mL/min~3mL/min的速度洗脱黄曲霉毒 素总量免疫亲和柱，得到洗脱液；（3)将所述洗脱液在氮吹仪下吹干，用乙腈-水溶液（乙 腈和水的体积比1:9)定容到lmL，涡旋混匀，过0. 22 μ m的有机滤膜，用液相色谱-质谱测 定，其中（3-1)质谱条件：电离方式为电喷雾电离，正离子；毛细管电压为3. 5kV ;锥孔电压 为40V ;离子源温度为120°C ;锥孔反吹气流量为50L/h ;脱溶剂气温度为350°C ;脱溶剂气 流量为500L/h ;电子倍增电压为650V ;扫描方式为多尚子反应监测；针对黄曲霉毒素M1， 离子选择参数包括：母离子312. 9,子离子240. 7和284. 6,碰撞能量是38和22,驻留时间 是0.05min ;针对黄曲霉毒素B1，离子选择参数包括：母离子329. 1，子离子259和273,碰 撞能量是25和25,驻留时间是0. lmin ; (3-2)液相色谱条件：流动相流动速度：0. 3mL/min ; 色谱柱柱温：40°C ;试液温度：20°C ;进样体积：10 yL ;流动相：A相，0. 1%甲酸溶液；B相， 乙腈溶液。
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