一种用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫法检测领域，具体地说是一种用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 循环肿瘤细胞(CTC)是指自发或因诊疗操作由实体瘤原发灶或转移灶释放进入外 周血循环的肿瘤细胞。转移是癌症相关死亡的主要原因，而CTC被视为转移的种子。CTC细胞 是目前认为癌症转移的种子之一。对癌症的早期诊断和预后都有重要的作用。但是我们在 研究过程中发现，目前的CTC检测方法无法区分有侵袭力和无侵袭力的CTC。由于CTC侵袭力 不同，以致于当检测到的CTC在5个以上后，CTC的个数和癌症病人的生存期并不完全相对 应。因此对于CTC的检测分析，有必要区分有侵袭力和无侵袭力的CTC。
[0003] 癌症干细胞(CSC)又称癌干细胞、肿瘤干细胞，是指具有干细胞的自我复制及多细 胞分化性质的肿瘤细胞，可以作为肿瘤细胞侵袭力判断的标志。
【发明内容】
[0004] 本发明的主要目的是针对上述【背景技术】存在的不足提供一种用于检测CTC侵袭力 的试剂盒，能分析出CTC中CSC的表达量，从而进行CTC侵袭力的检测。
[0005] 本发明是通过如下技术方案实现的：一种用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂 盒，它包括：
[0006] ⑶133、⑶24和⑶44抗体各自独立的与不同的寡核苷酸偶联得到的抗体-寡核苷酸 探针；
[0007] 用于将上述抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的扩增引物及缓冲液；
[0008] 还包括荧光探针。
[0009] 进一步的，所述抗体-寡核苷酸探针包括寡核苷酸探针部分和抗体部分;所述寡核 苷酸探针部分是将寡核苷酸的5 '端进行醛基修饰后得到的，所述抗体部分是将抗体进行肼 基修饰后得到的；所述寡核苷酸探针部分和所述抗体部分经过偶联得到所述抗体-寡核苷 酸探针。
[0010]更进一步的，所述寡核苷酸探针部分是将5'端带有氨基修饰的寡核苷酸，用摩尔 当量为5-20倍的SFB进行醛基修饰后得到的;所述抗体部分是将抗体用摩尔当量为10-50倍 的SANH进行肼基修饰后得到的。
[0011] 其中，上述的SFB是指4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯；上述的SANH是指4-(N-马来 酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯。
[0012] 所述抗体-寡核苷酸探针是将摩尔比为（7-10):1的寡核苷酸探针部分和抗体部 分，在室温条件下反应4-24小时后得到的。
[0013] 优选的，所述寡核苷酸的长度为16-22nt，5'端为6-14nt长度的引物识别序列，3' 端用延伸引物进行延伸扩展。
[0014]进一步的，所述延伸引物的长度为50-80nt，它的3'端末端与寡核苷酸的3'端互补 配对，5'端可以形成发卡结构，且中间序列与荧光探针的序列互补。延伸引物的序列优选为 SEQ ID NO: 14所示。
[0015]优选的，所述寡核苷酸的序列为SEQ ID NO: 1-13中所示的任一个。
[0016]所述扩增引物中包括一对用于将抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的正向、反向引 物，所述正向引物的5 '端与寡核苷酸互补。
[0017] 优选的，所述循环肿瘤细胞为宫颈癌、乳腺癌或前列腺癌循环肿瘤细胞中的一种 或多种。
[0018] 发明原理
[0019] 癌症干细胞是一类具有干细胞性质的癌细胞，也就是具有自我更新、分化能力、高 度增殖能力以及它们能在裸鼠形成肿瘤。癌症干细胞内部复杂的机制能够解释癌症耐药性 以及很多典型的肿瘤的行为。癌症发生的细胞假说就是指有一小部分亚群的肿瘤细胞有干 细胞的特质，有能力产生新的肿瘤。癌症干细胞不仅能诱导原发肿瘤的形成，还是引起肿瘤 化疗和放射治疗后复发的关键诱因。针对不同来源的肿瘤，肿瘤干细胞表面的生物标志物 不尽相同。
[0020] ⑶133、⑶24和⑶44都是癌症干细胞的细胞表面标识物。它们的表达不仅在癌症细 胞系中被发现，而且在宫颈癌、前列腺癌、头颈癌、肝脏肿瘤、脑癌、乳腺癌、肺癌等癌症患者 的组织中均有发现。且多标志物抗体的联合应用可有效提高检测敏感性和特异性(Journal of the National Cancer Institute,2009,101(1):61-66)〇
[0021] 因此可以通过平行检测这三种细胞表面标志物在血液中细胞表面的表达量高低 来判断癌症病人血液中CTC的侵袭力。
[0022]本发明具有如下有益效果：
[0023] 1.本发明所述的试剂盒通过将⑶133、⑶24和⑶44作为CSC的标识物，进行平行检 测CTC中各抗原的含量，从而得到CTC中CSC的表达量，分析出CTC的侵袭力高低。
[0024] 2.本发明通过偶联醛基和肼基得到抗体-寡核苷酸的方式，可以制备得到上述抗 体分别与寡核苷酸偶联的三种探针，每种抗体-寡核苷酸探针的寡核苷酸都不相同。从而可 以通过寡核苷酸的PCR扩增，来平行检测CTC中各抗体分别对应的抗原含量。
[0025] 3.用延伸引物对寡核苷酸的3 '端扩增，可以保证寡核苷酸链过短时的PCR扩增要 求，并且延伸引物5'端的发卡结构可以增加碱基的堆砌力，从而增强探针敏感性，使通用型 抗体-寡核苷酸探针检测更加灵敏。
[0026] 4.由于寡核苷酸与延伸引物是在3'端互补配对的，因此延伸扩展的过程在PCR扩 增过程中可自行反应，延伸扩展之后再以延伸后的抗体-寡核苷酸为模板进行扩增，一步反 应即可，反应效率高。
[0027] 5.由于采用了PCR扩增的方式，比传统ELISA方法检测的敏感度提高了几个数量 级，即使CTC的浓度很低，也可以对微量抗原进行检测。
【具体实施方式】
[0028]以下通过具体实施例来进一步说明本发明：下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0029] 本发明要得到抗体-寡核苷酸探针，其是通过先将寡核苷酸与抗体分别进行醛基 和肼基的定向修饰得到寡核苷酸部分和抗体部分，再进行腙键偶联得到。优选的，所述寡核 苷酸探针部分是将5'端带有氨基修饰的寡核苷酸，用摩尔当量为5-20倍的SFB进行醛基修 饰后得到的，优选摩尔当量为10倍;所述抗体部分是将抗体用摩尔当量为10-50倍的SANH进 行肼基修饰后得到的，优选摩尔当量为25倍。其中，SFB为4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯， SANH为4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯。用SFB修饰寡核苷酸的5'端 上的氨基可以得到醛基活化的寡核苷酸，用SANH修饰抗体可以得到肼基活化的抗体蛋白。 这两个反应为公开技术可以得到的，如中国文献"基于核酸分子杂交的免疫芯片抗体固定 新方法"，《分析化学》，2013年第2期，沙莎等公开的。反应时间、反应温度等条件可根据文献 内容做出本领域技术人员公知的调整。本发明优选的技术方案为:将5'端带有氨基修饰的 寡核苷酸用pH值为7.4的PBS缓冲液溶解，然后与摩尔当量为寡核苷酸10倍的SFB溶液混合， 室温反应2.5小时，再纯化得到醛基修饰的寡核苷酸探针部分。将抗体用pH值为7.4的roS缓 冲液稀释后，与摩尔当量为抗体25倍的SANH溶液混合，室温反应2.5小时，再纯化得到肼基 修饰的抗体部分。最后将摩尔比为(7-10): 1的寡核苷酸探针部分和抗体部分在室温下偶联 反应得到所述抗体-寡核苷酸探针。
[0030] 以下通过实施例1来进行进一步说明，其余未说明的具体条件及实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0031 ]本实施例中所述的"室温"是指常规的室内温度，一般为15_30°C。
[0032] 本实施例将序列为SEQ ID ^):(1-13)的01丨8〇简写为01丨8〇(1-13)，01丨8〇为寡核 苷酸。
[0033]本实施例中的PBS缓冲液为磷酸缓冲液，MES缓冲液为2-(N-吗啉代）乙磺酸缓冲 液。
[0034]本实施例中的QPCR为实时荧光定量PCR。
[0035] 本实施例中的Nanodrop为分光光度计。
[0036] 本实施例中的BCA法是指蛋白质浓度测定的定量方法。
[0037] 本实施例所用的缓冲液为:配置不同pH值的roS缓冲液，在本发明的【具体实施方式】 中，具体包括pH值为6.0的PBS缓冲液，以及pH值为7.4的PBS缓冲液，并且配置pH值为5.0的 MES缓冲液，过滤除菌处理，4 °C存放。
[0038]实施例1⑶133-寡核苷酸探针 [0039] (1)寡核苷酸探针的醛基修饰
[0040] 将50nmol的Oligol(寡核苷酸）用0.1M的pH 7.4的磷酸缓冲液配置成溶液。称取 500nmo 1的SFB(4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯），用无水DMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶解后，在 室温反应2.5h，过柱纯化得到01ig〇-FB(醛基修饰的寡核苷酸）。
[0041 ] 检测01ig〇-FB的浓度：用Nanodrop分光光度计检测A·的值，计算Oligo-FB的浓度 为0·73nmol/yL〇
[0042]检测醛基修饰率：用定量的2-肼吡啶-2-盐酸盐溶液检测醛基修饰率。取上述 01ig〇-FB加入到2-肼吡啶-2-盐酸盐溶液中，振荡混匀后于37°C反应lh，用Nanodrop检测 360nm处的吸光值为1 · 41，计算其修饰率，A36Q下的修饰率为0 · 79。
[0043] (2)抗体⑶133的肼基修饰
[0044] 对抗体⑶133进行脱盐纯化后用Nanodrop检测抗体蛋白浓度为5mg/mL。
[0045]用pH值为7.4的磷酸缓冲液稀释抗体⑶133至浓度为2.8mg/mL。称取30倍量SANH (抗体与SANH的摩尔比为1:30)，溶解在无水DMF中，再加入到抗体中，在室温反应2.5h，过柱 纯化得到⑶133-SANH(肼基修饰的⑶133)。
[0046] 检测CD133-SANH的浓度:通过BCA法计算修饰后的CD133-SANH的浓度为2.2mg/mL。
[0047] 检测肼基修饰率：用定量的2-甲酰苯磺酰钠盐溶液检测肼基修饰率。取纯化后的 抗体-SANH加入到的2-甲酰苯磺酰钠盐溶液中，涡旋混匀后于37°C反应lh，Nanodrop检测 348nm处的吸光值为0.42。通过348nm处的吸光值和CD133-SANH的浓度计算出CD133-SANH的 肼基修饰率为6.5。
[0048] (3)01ig〇-FB 与 CD133-SANH 的偶联
[0049] 将01ig〇-FB与⑶133-SANH按照摩尔比7:1混合涡旋混匀，室温反应4h，最后得到的 产物经过过柱纯化后即可得到所述通用型⑶133-Oligo探针。
[0050] 取CD133_01igo探针进行Nanodrop检测。在354nm下有明显吸收峰出现，说明 01 igo-FB 与 CD133-SANH 的偶联成功。
[0051 ] 取CD133-01igo探针进行SDS-PAGE检测，分析CD133与oligo偶联程度，跟纯的 ⑶133比较，得到多条电泳条带，说明⑶133上偶联了不同数量的寡核苷酸。
[0052]取⑶133-Oligo探针进行BCA法浓度检测。BCA法浓度检测计算偶联物抗体的浓度。 用单链定量试剂盒定量CD133-01igo中Oligol的浓度。可以计算出CD133与Oligol的比例， 并可以和修饰率结果比较。说明了⑶133-Oligo分子中Oligol与抗体的偶联比，结果如表1 所示。
[0053] 表1CD133-Oligo分子中Oligo与抗体的偶联比
[0054]
[0056] Oligo分子的QPCR扩增特异性检测
[0057] 将01ig〇l-13分子稀释