变化曲线，最终给出血小板聚集率 和药物抑制率。试剂卡四个通道的血小板聚集检测结果见图3。本实施例测得的ADP激活途 径的血小板聚集百分率PAP%为29.7%，对应的氯吡格雷药物对血小板的聚集抑制率Inh% 为70.3%，有药效。
[0080] 实施例4
[0081 ] 不同程度P2Y12受体抑制
[0082] 称取适量氯吡格雷(Clopidogrel)，用DMS0溶解，并稀释成4个梯度：lmM，2mM，4mM， 8mM，现配现用。取数支3.2 %枸橼酸钠抗凝的未服药人群血样，将血样混合在一起颠倒混合 均匀，按2mL/支分装至枸橼酸钠抗凝的采血管中，共分装5管，分别编号1、2、3、4和5(采血管 事先用蒸馏水清洗干净并烘干，主要是防止抗凝剂比例过高，影响检测结果）。
[0083] 取2yL溶解的ImM，2mM，4mM和8mM氯吡格雷分别加入到1，2，3，4号采血管中，使氯吡 格雷终浓度分别为lyM，2yM，4yM和8yM;取2yL DMS0加入到5号采血管中，用作对照试验。将5 支采血管分别轻轻颠倒10次，使得氯吡格雷与血样充分混匀，37度孵育1小时。
[0084] P2Y12受体活性检测
[0085] 上述实验孵育结束后，取血样1通过本发明涉及的试剂卡在相配套的光学检测设 备上检测氯吡格雷对P2Y12受体活性的抑制率，通过软件自动绘制曲线并计算抑制率，并依 次完成2,3,4,5号血样的检测，各样品通道1￥血小板聚集检测结果六881￥见图4。从图4可以 看出，本发明涉及的试剂卡在与相配套的光学检测设备协同作用下，成功的检测了P2Y12受 体拮抗剂处理下血小板的聚集程度以及药物抑制率。表明本发明提供的简单快速的方法检 测血小板聚集功能以及噻吩并吡啶类抗血小板药物疗效可行。
[0086] 实施例5
[0087] 在本实施例中，将本发明的试剂卡检测与LTA法检测进行对比，考察两种方法的检 测结果相关性。
[0088] LTA法检测血小板聚集
[0089]随机选取17例服用氯吡格雷药物患者，采集静脉血，每例分别取1支3.2%枸橼酸 钠抗凝真空管采血2mL，另取2支用3.8 %枸橼酸钠分别采血3mL。2只3.8 %枸橼酸钠抗凝的 样品分别经600g、5min和2400g、15min离心得到富血小板血衆(platelet rich plasma， PRP)和贫血小板血楽Xplatelet poor plasma，PPP)，并用PPP调整PRP的血小板个数为（100 ~300) X 103个/此，本实施例中优选200X 103个/此。取500yL PRP和PPP，分别加入至比色杯 中，使用CR0N0-L0G血小板聚集仪检测，以PPP为最大参照，设定聚集率为100% ;以PRP为最 小参照，设定聚集率为0% ;终浓度20yM ADP为诱聚剂加入至PRP，PRP中透光度改变最大时 得到血小板最大聚集率(max aggregation ratio，MAR)，以百分数表示。1支3.2%枸橡酸盐 抗凝样品用于本发明涉及的试剂卡检测。将LTA法检测的MAR值与本发明的试剂卡检测得到 的血小板聚集百分率进行相关性分析。
[0090] LTA法检测的血小板聚集率MAR%与本发明的试剂卡检测得到的血小板聚集百分 率PAP%呈正相关，一致性较高，R2 = 0.8505,两者相关性见图5。所不同的是，LTA法检测血 小板聚集需要对全血进行离心处理，分离PRP和PPP，操作步骤繁琐，本发明的试剂卡检测血 小板聚集功能无需离心，只需一步操作，即可对全血样品进行血小板聚集功能检测。同时 PRP中的血小板所处环境与全血中血小板所处环境有较大的差别，导致血小板不能处于最 佳活性状态，血小板的聚集功能检测结果不能完全与人体环境相似。本发明涉及的试剂卡 检测的血小板聚集率略低于LT A法检测的MAR值，这是因为血小板上与ADP结合的受体有 P2Y1和P2Y12两种，本发明涉及的试剂卡通过加入了 A2P5P和A3P5P，抑制了 ADP与P2Y1受体 结合，从而特异性的检测患者服用噻吩并吡啶类抗血小板药物的疗效。
[0091] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的试剂卡及其使用方法和应 用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所 属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换 及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1. 一种检测噻吩并吡啶类抗血小板药物疗效的试剂卡，其特征在于，所述试剂卡包括 依次并行排列的彼此独立的四个检测通道，检测通道I中含有通道I检测试剂，所述通道I检 测试剂含有将活化后的染料微球与血小板Gp II b/ma受体配基通过酰胺键牢固结合，而 后加入凝血因子，冻干制得的冻干剂;检测通道II中含有通道II检测试剂，所述通道II检测 试剂含有血小板最大激活剂的冻干剂;检测通道III不含有检测试剂，检测通道IV中含有通 道IV检测试剂，所述通道IV检测试剂含有血小板P2Y12受体激活剂和P2Y1受体拮抗剂的冻 干剂。2. 根据权利要求1所述的试剂卡，其特征在于，所述染料微球为蓝色染料微球和/或绿 色染料微球； 优选地，所述染料微球的粒径为2-6微米； 优选地，所述染料微球为聚苯乙烯或聚二苯乙烯材质； 优选的，所述染料微球功能基团为羧基基团，GpIIb/IIIa受体配基的氨基基团与微球 羧基基团通过酰胺键牢固结合，均匀分布在微球表面。3. 根据权利要求1或2所述的试剂卡，其特征在于，所述Gp II b/ma受体配基为兔纤维 蛋白原、牛纤维蛋白原或人纤维蛋白原中的任意一种或至少两种的组合;优选地，所述凝血 因子为凝血因子IV; 优选地，当试剂卡中通入待测液体样品后，所述凝血因子的浓度为〇.5-3mM。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的试剂卡，其特征在于，所述血小板最大激活剂为凝 血酶、凝血酶受体激活肽TRAP-14或其衍生物中的任意一种或至少两种的组合； 优选地，当试剂卡中通入待测液体样品后，所述血小板最大激活剂的浓度为20-100μΜ。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的试剂卡，其特征在于，所述Ρ2Υ12受体激活剂为二 磷酸腺苷或其钠盐、钾盐或水合物； 优选地，当试剂卡中通入待测液体样品后，所述Ρ2Υ12受体激活剂的浓度为10-50μΜ; 优选地，所述Ρ2Υ1受体拮抗剂为Α2Ρ5Ρ和/或Α3Ρ5Ρ; 优选地，当试剂卡中通入待测液体样品后，所述Ρ2Υ1受体拮抗剂的浓度为20-200μΜ。6. 根据权利要求1-5中任一项所述的试剂卡，其特征在于，所述通道I、通道II和通道IV 中还含有冻干的冻干保护剂、助悬剂及防腐剂； 优选地，所述冻干保护剂为蔗糖、乳糖、牛血清白蛋白或吐温80中的任意一种或至少两 种的组合； 优选地，当试剂卡中通入待测液体样品后，所述冻干保护剂的浓度为20g/L-100g/L; 优选地，所述助悬剂为微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮中的任意一种或至少两 种的组合； 优选地，当试剂卡中通入待测液体样品后，所述助悬剂的浓度为30g/L-80g/L; 优选地，所述防腐剂为叠氮化钠； 优选地，当试剂卡中通入待测液体样品后，所述防腐剂的浓度为〇.lg/L-lg/L。7. 根据权利要求1-6中任一项所述的试剂卡，其特征在于，所述噻吩并吡啶类抗血小板 药物为噻氯匹定、氯吡格雷或普拉格雷中的任意一种或至少两种的组合。8. 根据权利要求1-7中任一项所述的试剂卡，其特征在于，所述试剂卡还包括进样口、 储液池和样品流动通道，进样口与储液池连通，储液池与样品流动通道连通，样品流动通道 与所述四个检测通道连通。9. 一种利用如权利要求1-8中任一项所述的试剂卡进行检测的方法，其特征在于，所述 方法为： 使待测液体样品通过进样口进入试剂卡的样品流动通道，样品沿着样品流动通道流动 至所述四个检测通道中，检测通道III不含检测试剂作为空白对照，检测通道Ι、π和IV中的 检测试剂溶解在样品中，检测试剂与样品中成分发生反应，相对于空白对照产生信号变化， 通过信号变化来完成对样品的检测。10. 根据权利要求1-8中任一项所述的试剂卡在制造检测噻吩并吡啶类抗血小板药物 疗效的装置中的应用。
【专利摘要】本发明提供一种检测噻吩并吡啶类抗血小板药物疗效的试剂卡及其使用方法和应用，所述试剂卡包括依次并行排列的彼此独立的四个检测通道，检测通道I中含有通道I检测试剂，所述通道I检测试剂含有将活化后染料微球与血小板GpⅡb/Ⅲa受体配基通过酰胺键牢固结合，而后加入凝血因子，冻干制得的冻干剂；检测通道II中含有通道II检测试剂，所述通道II检测试剂含有血小板最大激活剂的冻干剂；检测通道III不含有检测试剂，检测通道IV中含有通道IV检测试剂，所述通道IV检测试剂含有血小板P2Y12受体激活剂和P2Y1受体拮抗剂的冻干剂。通过本发明的试剂卡可以简单快捷准确地检测噻吩并吡啶类抗血小板药物疗效。
【IPC分类】G01N33/15, G01N33/53
【公开号】CN105717263
【申请号】CN201610125470
【发明人】陈勇, 田宇, 王玲
【申请人】北京乐普医疗科技有限责任公司
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2016年3月4日