一种原油降解菌的快速筛选方法
【专利说明】-种原油降解菌的快速筛选方法
[0001]
技术领域
[0002] 本发明设及微生物筛选方法技术领域，具体设及一种原油降解菌的快速筛选方 法。
【背景技术】
[0003] 原油及其副产品作为一种重要的能源物质和工业原料正在被世界各国的人们广 泛开采，其在社会经济发展中具有非常广泛的作用与功能。但由于有限的技术及淡薄的环 保意识，使得环境中原油污染日益严重，破坏了正常的生态平衡。仅1996-1999年间在阿拉 斯加每年大概都有407起原油泄漏事故;2010年大连新港原油泄漏事件，至少污染了附近50 平方公里的海域，影响范围达100平方公里。全世界每年约有800万吨石油进入环境，如何安 全有效地对石油污染的水和±壤环境进行修复，降低生态风险，已成国际焦点问题。
[0004] 常用的原油污染修复手段有物理法、化学法及生物修复法。近年来，物理法和化学 法因为成本高，操作复杂，对设备要求高，会产生二次污染等缺点，逐渐被生物修复法代替。 生物修复法是利用微生物自身的代谢来分解污染物，其最终产物是C〇2、也0等物质，不会对 环境产生二次污染，所W被认为是一种绿色的处理方法，而且利用菌株能降解一些用物理、 化学方法不易降解的物质。
[0005] 环境中主要参与烧控降解的有细菌，真菌和酵母，目前研究发现降解活性最强，适 用性最广的是细菌。目前，在对一些环境的研究中，已经分离或检测到多种原油降解菌，如 表1显示为不同环境原油降解菌群落(龙吴知，2014)。然而大量菌株其降解原油能力强弱的 筛选花费了很多人力物力。本发明提供一种原油降解菌快速筛选方法，可W快速并大量检 测菌株的原油降解能力，并且测试结果准确可靠。
[0006]
a.克隆文库或降解菌群落中序列或菌属百分比(括号内）。
[0007] b.每个菌口中各菌属百分比(无括号）。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种原油降解菌的快速筛 选方法。
[0009] 为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:一种原油降解菌的快速筛选方法， 包括W下步骤： 1) 将分离纯化得到的待测原油降解菌接种到液体培养基中，制成菌悬液； 2) 待步骤1)得到的菌悬液生长到对数期后，使用无菌牙签沾取后接种于W原油为唯一 碳源的MM固体培养基中，在20~30°C的条件下培养，培养期为15d，得到培养菌落； 3) 对步骤2)得到的培养菌落进行观察，W菌落直径或菌落颜色判断待测原油降解菌的 原油降解能力。
[0010] 进一步的，上述的一种原油降解菌的快速筛选方法，所述步骤1)中，待测原油降解 菌的分离纯化方法为：将5g受原油污染的±样置于45mL浓度为0.85%的生理盐水中震摇 3〇111山，取±壤悬液梯度稀释，涂布到21化固体培养基上，于20°C下倒置培养待长出肉眼可 见的单菌落;分离纯化后，挑取单菌落于21化液体培养基中摇培成菌悬液。
[0011] 进一步的，上述的一种原油降解菌的快速筛选方法，所述21化固体培养基的组成 为：乙酸钢1. Og，膜蛋白腺10.0 g，酵母提取物2. Og，巧樣酸钢0.5g，硝酸锭0.2g，营养肉汤培 养基0X0ID 0.5g，琼脂粉15g，dd出0 1L，抑调节至7.6;所述21化液体培养基的组成为：乙酸 钢1. Og，膜蛋白腺10.0 g，酵母提取物2. Og，巧樣酸钢0.5g，硝酸锭0.2g，营养肉汤培养基 0乂010 0.5邑，（1地2〇比，口的周节至7.6。
[0012] 进一步的，上述的一种原油降解菌的快速筛选方法，所述步骤2)中，MM固体培养基 的组成为：氯化儀3.5g，硝酸锭1. Og，氯化钟0.35g，氯化巧0.05g，漠化钟0.08g，氯化铁 0 .Olg，含有硫酸锋0.01%、氯化锁2.4%的金属盐溶液ImL，含有憐酸氨二钟10%、憐酸二氨钟 10%的憐酸盐溶液10血，琼脂糖15g，d地2〇定容至1L，抑调节至7.5，最后加入体积百分比为 2〇/〇的原油。
[0013] 本发明的有益效果为:本发明提供的一种原油降解菌的快速筛选方法，可一次检 测多个菌株是否具有较强的原油降解能力，同时得到多个菌株的降解结果，且操作简单，效 率高，节省时间，具有很好的推广使用价值。
【附图说明】
[0014] 图1为原油MM固体培养基上菌落的生长情况示意图，其中A为菌株YF28-1(8)，B为 菌株YF24-3(3)，C为菌株TGkY2。
[0015] 图2为降解菌株在原油MM液体培养基摇瓶培养结果示意图。
[0016] 图3为降解菌株对原油降解前后气相图谱，其中A为阴性对照，B为菌株TGL-Y2，c为 菌株 YF28-1(8)，D 为菌株 YF24-3(3)。
【具体实施方式】 [0017]实施例1: 原油降解菌降解能力强弱的筛选： 1、培养基的配制： 21化培养基：乙酸钢1. Og，膜蛋白腺10 . Og，酵母提取物2. Og，巧樣酸钢0.5g，硝酸锭 0.2邑，营养肉汤培养基(0乂010)0.5邑，(1地20比，口的周节至7.6左右。
[0018] MM培养基:氯化儀3.5g，硝酸锭1. Og，氯化钟0.35g，氯化巧0.05g，漠化钟0.08g，氯 化铁0.0 lg，金属盐溶液1血(硫酸锋0.01%，氯化锁2.4%)，憐酸盐溶液10血(憐酸氨二钟10%， 憐酸二氨钟10%)，琼脂糖15g，dd出0定容至lL，pH调节至7.5左右，最后加2%(乂八)原油。
[0019] 2、原油降解菌的分离纯化： 将5g受原油污染的±样于45mL生理盐水(0.85%)中震摇30min，取±壤悬液梯度稀释， 涂布到21化固体培养基上，于2(TC下倒置培养。分离纯化后，挑取单菌落于21化液体培养基 中摇培成菌液分成两部分处理:一部分用20%灭菌甘油于-80°C冰柜中保存；另一部分进行 后续实验。
[0020] 3、原油降解菌的降解能力测定： 将步骤2中获得的菌液用牙签接种到W原油为唯一碳源的MM固体