用于治疗线粒体相关的疾病的α1-微球蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明是基于以下发现，g卩α 1-微球蛋白（AIM)在防止线粒体损伤中起重要的作 用。AlM连接至复合物I亚基，从而保护线粒体的结构和功能。线粒体涉及人类多种疾病并 且本发明的发现支持AlM在治疗线粒体相关的疾病中的用途。
【背景技术】
[0002] 线粒体是真核细胞中的细胞器。它们产生大部分三磷酸腺苷（ATP)的细胞供应， 三磷酸腺苷作为能源使用。因此，线粒体对于能量生产、真核细胞的存活以及正常的细胞功 能来说是必不可少的。除了供应能量，线粒体涉及大量其他过程如细胞信号传导、细胞分 化、细胞死亡以及细胞周期和细胞生长的控制。特别地，线粒体是细胞凋亡的关键的调节因 子并且它们在多种形式的非凋亡细胞死亡如细胞坏死中起重要作用。
[0003] 近年，已经出版了许多论文说明线粒体导致多种疾病。一些疾病是由线粒体基因 组的突变和缺失引起的，而其他则是由线粒体功能的损伤导致。目前，存在可行的可以治疗 线粒体疾病的疗法。
[0004] 考虑到维持或恢复正常的线粒体功能的识别的重要性，存在需要以鉴定可以用于 保护线粒体结构和功能的物质或者鉴定可以用来恢复或治疗线粒体的功能障碍的物质。
[0005] α 1-微球蛋白（AIM)是26kDa的血浆和组织蛋白，其分离并表征自包括人和鲽鱼 的多个物种的血浆、肝脏和尿液（31)。在血浆中，发现AlM是以游离的形式以及共价连接至 其他更大的血浆蛋白的形式。在人体中，AlM与IgA、白蛋白以及凝血酶原形成复合物（5)。 游离的AlM和各种高分子量的复合物也存在于所有组织的细胞外基质中，二者均来自血浆 以及外周组织合成（4)。在组织中，AlM优选定位于血管的血液和组织之间、肺部空气和组 织之间、以及胎盘中母亲和胎儿之间的界面，特别是损伤位点处。还不清楚AlM的生理功 能，但是已经证明其具有还原酶活性，而且结合游离的血红素和自由基，这表明它在具有氧 化应激的环境期间具有保护功能（31)。AlM结合至许多细胞类型，在许多情况下随后内化 (internalization)(36, 49)〇
【发明内容】
[0006] 本发明人已经对细胞摄入AlM进行了的详细研究，并在此过程中发现该蛋白主要 定位于受损细胞的线粒体，并且可以保护线粒体的结构和功能。
[0007] 本发明涉及AlM预防或治疗线粒体相关疾病的用途。如实施例中所示，AlM对于 暴露于过量压力以及被迫高速率生产ATP的细胞具有有益的作用。在这种情况下，尽管存 在环境压力，AlM能够维持细胞的ATP产生。由于AlM结合至呼吸链的复合物的亚基，认为 AlM通常可用于预防或治疗涉及线粒体受损或损伤的疾病或涉及线粒体功能损害（至少部 分）的疾病。
[0008] 线粒体疾病来自于线粒体障碍，其是存在于身体的每个细胞中（除了红血细胞之 外）的专门的腔室。当线粒体障碍时，细胞内产生越来越少的能量，并且随后是细胞损伤或 乃至细胞死亡。如果整个身体重复该过程，则严重危害发生该过程的人的生命。
[0009] 线粒体疾病最经常出现在非常需要能量的器官如脑、心脏、肝脏、骨骼肌、肾和内 分泌系统以及呼吸系统。
[0010] 线粒体疾病的症状可以包括运动控制丧失、肌无力和疼痛、癫痫发作、视觉/听觉 问题、心脏疾病、肝脏疾病、胃肠功能紊乱、吞咽困难等。
[0011] 线粒体疾病可能是遗传获得或可能是由于自发突变，这导致改变通常位于线粒体 中的蛋白质或RNA分子的功能。
[0012] 已发现许多疾病涉及线粒体缺陷如复合物Ι、Π 、ΙΙΙ或IV缺陷或酶缺陷如丙酮酸 脱氢酶缺乏。然而，情况是复杂的并且该疾病可能涉及许多因素。
[0013] 截至目前，没有可用的根治疗法。可用的唯一治疗方法是使得可以减轻症状并延 缓疾病的进展。
[0014] 因此，本发明人的调查结果以及本文的描述是非常重要的，因为它们证明了 AlM 对于维持线粒体结构以及恢复诱导的线粒体缺陷的能力对线粒体的有益作用。
[0015] 本发明涉及AlM用于治疗线粒体疾病。这类疾病包括，但不限于，神经系统、脑、心 脏、肝脏、骨骼肌、肾和内分泌以及呼吸系统中的疾病。许多疾病可能具有线粒体缺陷，因 此，除本发明提到的那些之外的更多的疾病也可能与使用AlM的治疗或预防相关。
[0016] 无论是偶然的、压力诱导或凋亡的细胞死亡经常涉及细胞降解和回收程序的活化 (Z)。因此，细胞死亡是依赖于能量的过程，需要保留的以及完整的线粒体功能。表明线粒 体的自噬排除（线粒体自噬）在程序性细胞死亡中发挥重要作用（益)。因此，在程序性细 胞死亡过程中存在对功能化线粒体的需要，但是尚未了解这是如何实现的。
[0017] 复合物Ι、Π 、ΙΙΙ和IV是嵌于线粒体内膜的蛋白复合物。它们被称为呼吸链和通 过偶联电子供体（如NADH)与电子受体（例如O2)之间的电子传递与H+离子的传递起作 用。通过葡萄糖、丙酮酸和NADH(这些都产生于细胞的细胞质基质中）的氧化，在内膜上获 得的电化学质子梯度用来产生三磷酸腺苷（ATP)形式的化学能。该细胞呼吸过程，也称为 有氧呼吸，依赖于氧的存在。当氧气有限时，糖酵解产物将通过厌氧发酵代谢，该过程不依 赖于线粒体。有氧呼吸期间由葡萄糖生产的ATP比发酵高出约13倍。
[0018] 本发明人已经证明人血浆和组织中的低分子量蛋白AlM结合至线粒体以及更特 别地结合至线粒体复合物I。此外，证明该蛋白能够保护线粒体免于血红素诱导的肿胀以及 ATP生产能力的损耗。基于这些发现，我们认为AlM可能参与细胞持家机制。AlM可以通过 目前还不知道的许多不同的机制施加这种保护。不管作用机制，本文报道的研究明确表明， AlM对于线粒体具有有益作用，因此，AlM是用于治疗或预防线粒体疾病的潜在药品。此外， AlM可以用于预防和/或治疗经受引起这种副作用的药物治疗的患者中的线粒体副作用。 实例包括用他汀类药物等的治疗。此外，AlM可以在化妆品中使用，例如，用于治疗皮肤的 年龄相关的修饰，或者它可以用于预防和/或治疗由我们环境中的物质或条件所引起的不 希望的线粒体作用。
[0019] 如上面提到的，AlM结合至复合物I的亚基。这可以表明AlM尤其适用于线粒体 疾病的治疗，其中，在呼吸链中存在缺陷。更特别地，它可以表明AlM特别适合用于治疗复 合物I缺乏或复合物I相关的疾病。
[0020] 如本文的实施例中所报告的，诱导细胞凋亡用来模仿以引起细胞的质膜损伤和外 部屏障破坏的压力诱导的细胞损伤为特征的情况。细胞能够内化碘化丙啶（PI)后就以高 亲和力将外源性AlM结合在细胞内，这表明摄入机制是AlM从细胞外隔室被动泄漏。因此， AlM结合至线粒体也应该发生在具有破裂质膜的坏死细胞中。越来越明显地是，许多体内坏 死性细胞死亡形式实际上可以描述为系列调节的ATP依赖的细胞蜕变事件，即按照称为坏 死的特定途径的程序性坏死（Z，M)。因此，在非自噬性细胞死亡期间，对于AlM可能的作用 是参与保留在凋亡和坏死性细胞以及其他可能类型的坏死细胞中的线粒体功能以确定用 于能量依赖性细胞降解过程中的ATP的可用性。
[0021] 线粒体结构和功能的保护机制是未知的。基于其还原酶，AlM归因于抗氧化功能以 及血红素和基团结合性质（2, 53)。因此，可以推测，这些性质都参与保护作用。可替代地， 由于AlM似乎是至少一种大蛋白复合物（复合物I)中的内源组分，它可能对于复合物具有 结构稳定的作用。在凋亡、坏死和其他形式的细胞死亡期间，外源性AlM的另外结合对于维 持呼吸蛋白复合物的理化结构和功能可能是必要的。另一种可能性是AlM结合至复合物I 可能对线粒体内膜的其它组分如孔蛋白或膜脂质具有有益的作用。
[0022] 本发明研究了 AlM和线粒体之间的相互作用，并在多种不同的细胞类型中观察到 特异性结合，即淋巴细胞、髓细胞和白细胞起源的人血细胞，人角质化细胞以及小鼠离体肝 脏线粒体。总之，我们的研究结果表明，本文中研究的相互作用和保护性作用可以推至所有 类型的细胞。
[0023] 如本文所报告的，发现AlM与四种不同蛋白的相互作用：NADH脱氢酶复合物的疏 水部分中的NDUFAB1亚基（姐)、N-乙酰葡糖胺激酶（M)、snRNA结合蛋白LSm5 (迎)、和癌抗 原NY-C0-3 (M)。四种蛋白质都不是假阳性的，即与DNA结合诱饵融合蛋白或融合至它的任 何蛋白质相互作用。因此，这些候选物被视为酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system) 中真正的AIM相互作用蛋白。考虑到通过酵母双杂交系统分离的11个克隆体中的8个都 是相同的复合物I亚基，该蛋白被视为最感兴趣的蛋白，因此被选作进一步研究的目标。结 合至线粒体也被替代的方法途径所支持，并且连接的功能性作用可以归因为与AlM的抗氧 化功能兼容。然而，可以推测AlM结合至N-乙酰葡糖胺激酶、snRNA结合蛋白LSm5、以及 NY-C0-3的生理影响。这些蛋白分别定位于细胞质、细胞核和质膜，并且结合至这些蛋白质 的作用可以将AlM内化至除线粒体以外的其他细胞腔室。另一种可能性是结合至这三种蛋 白反映了 AlM与抗氧化和自由基清除无关的其他功能。
[0024] AlM是脂质运载蛋白的蛋白家族的成员。脂质运载蛋白（通常具有约20-25 %的氨 基酸序列相似性，并且共有表示共同进化起源的某些结构的共同特征）构成了来自细菌、 植物和动物的约50种蛋白的功能上不同的组（11，！^，处)。有趣的是，在植物和绿藻中发现 的两种脂质运载蛋白（紫黄质脱环氧化酶（VDE)和玉米黄质环氧化酶（ZDE))位于叶绿体 的类囊体膜（植物生产ATP的光合细胞器），其中，它们与光收集系统II相连接并且参与叶 黄素光保护系统（参考（11))。在紫黄质保护周期以及本文中的结果之间存在着明显的相 似：在植物和动物的能量转换细胞器中存在脂质运载蛋白类型的保护系统。假设线粒体和 叶绿体具有共同的原核或真核祖先（比照（垃，迎，迎)），可以推测，这两种脂质运载系统进 化上是相关的。
[0025] 当细胞受到致命的损伤时，其将最终降解并且其组分再循环。这通常是高度复杂 和耗能的过程，其需要充分控制以保护周围的环境即相邻细胞和组织免受进一步的损害。 在此过程中保留和维持线粒体能量机制是至关重要的。我们表明血浆和组织糖蛋白AIM在 维持线粒体能量生产中具有重要作用，并且同时帮助呼吸链，从而防止与健康组织不期望 的破坏性反应。因此，这些研究结果提出了维持线粒体稳定的新机制。
[0026] 在本发明上下文中，术语"α 1-微球蛋白"意图涵盖在SEQ ID NO :1(人AIM)，以 及SEQ ID NO :2(人重组AIM)以及同源物、片段或具有相似的治疗活性的它们的变体中识 别的α?-微球蛋白。在优选的方面，α?-微球蛋白与根据本文识别的SEQ ID NO :1或2 一致。在序列表中给出了人AlM和人重组A1M(分别为SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2)的氨 基酸序列以及相应的核苷酸序列（分别为SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4)的序列表。
[0027] 根据本文中描述的也可以使用如上面所提及的AlM的同源物。理论上，可以使用 来自包括迄今为止发现的最原始的（其是来自鱼（鲽鱼））所有物种的AIM。AlM也可以以 来自人、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、牛和鲽鱼的离体形式提供。
[0028] 考虑到AlM的同源物、变体和片段，以下已被识别为蛋白质的重要部分：
[0029] Y22 (酪氨酸，第22位，碱基对64-66)
[0030] C34 (半胱氨酸，第34位，碱基对100-102)
[0031] K69(赖氨酸，第69位，碱基对205-207)
[0032] Κ92 (赖氨酸，第92位，碱基对274-276)
[0033] Kl 18 (赖氨酸，第118位，碱基对352-354)
[0034] Κ130 (赖氨酸，第130位，碱基对388-390)
[0035] Υ132 (酪氨酸，第132位，碱基对394-396)
[0036] L180 (亮氨酸，第180位，碱基对538-540)
[0037] 1181(异亮氨酸，第181位，碱基对541-543)
[0038] P182 (脯氨酸，第182位，碱基对544-546)
[0039] R183 (精氨酸，第183位，碱基对547-549)
[0040](整个文件中的氨基酸和核苷酸的编号是指SEQ ID 1和3 ;如果使用来自其他物 种的其他AIM、AlM类似物或其重组序列，本领域技术人员将