技术特征：
1.一种确定突变的方法，包括：a.将细胞群体暴露于基因编辑方法，其中，所述基因编辑方法利用被配置成在靶序列中实现突变的试剂；b.从所述群体中分离出单细胞；c.提供来自单细胞的细胞裂解物；d.使所述细胞裂解物与至少一种扩增引物、至少一种核酸聚合酶和核苷酸混合物接触，其中所述核苷酸混合物包括至少一种终止子核苷酸，所述终止子核苷酸终止由所述聚合酶进行的核酸复制，以及e.扩增所述靶核酸分子以生成多个终止的扩增产物，其中所述复制通过链置换复制进行；f.将步骤(e)中获得的分子连接到衔接子上，从而生成扩增产物文库；g.对所述扩增产物文库进行测序，以及h.将扩增产物序列与至少一种参照序列进行比较，以识别至少一个突变。2.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个突变存在于所述靶序列中。3.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个突变不存在于所述靶序列中。4.如权利要求1所述的方法，其中所述基因编辑方法包括使用crispr、talen、zfn、重组酶、大范围核酸酶或病毒整合。5.如权利要求1所述的方法，其中所述基因编辑技术包括使用基因治疗方法。6.如权利要求5所述的方法，其中基因治疗方法未配置为修饰细胞的体细胞dna或种系dna。7.如权利要求1所述的方法，其中所述参照序列是基因组。8.如权利要求1所述的方法，其中所述参照序列是特异性决定序列，其中所述特异性决定序列被配置为与所述靶序列结合。9.如权利要求8所述的方法，其中所述至少一个突变存在于与所述特异性决定序列有至少1个碱基不同的序列区域中。10.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个突变包含插入、缺失或置换。11.如权利要求1所述的方法，其中所述参照序列是crispr rna(crrna)序列。12.如权利要求1所述的方法，其中所述参照序列是单向导rna(sgrna)序列。13.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个突变存在于与催化活性cas9结合的序列区域中。14.如权利要求1所述的方法，其中至少一些所述扩增产物包含条形码。15.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括在连接到衔接子之前，从所述终止的扩增产物中去除至少一种终止子核苷酸。16.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个突变发生在少于1％的所述细胞群体中。17.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个突变发生在不超过0.0001％的所述细胞群体中。18.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个突变发生在不超过0.01％的所述扩增产物序列中。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个突变存在于与dna修复酶的结合不相关的序列区域中。20.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个突变存在于与mre11的结合不相关的序列区域中。21.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括识别先前由另一种脱靶检测方法测序的假阳性突变。22.如权利要求21所述的方法，其中所述脱靶检测方法是计算机模拟预测、chip-seq、guide-seq、circle-seq、htgts(高通量全基因组易位测序)、idlv(整合缺陷型慢病毒)、digenome-seq、fish(荧光原位杂交)或discover-seq。23.如权利要求1所述的方法，其中所述单细胞是癌细胞。24.如权利要求1所述的方法，其中所述单细胞是神经元或神经胶质细胞。25.如权利要求1所述的方法，其中所述单细胞是胎儿细胞。26.一种识别特异性决定序列的方法，包括：a.提供核酸的文库，其中至少一些所述核酸包含特异性决定序列；b.对至少一个细胞执行基因编辑方法，其中所述基因编辑方法包括使所述细胞与包含至少一种特异性决定序列的试剂接触；c.使用权利要求1所述的方法对所述至少一个细胞的基因组进行测序，其中识别与所述至少一个细胞接触的所述特异性决定序列；以及d.识别提供最少脱靶突变的至少一种特异性决定序列。27.如权利要求26所述的方法，其中所述脱靶突变是同义或非同义突变。28.如权利要求26所述的方法，其中所述脱靶突变存在于基因编码区之外。29.一种体内突变分析的方法，包括：a.对活生物体中的至少一个细胞执行基因编辑方法，其中所述基因编辑方法包括使所述细胞与包含至少一种特异性决定序列的试剂接触；b.从所述生物体中分离出至少一个细胞；c.使用权利要求1所述的方法对所述至少一个细胞的基因组进行测序。30.如权利要求29所述的方法，其中所述方法包括至少两个细胞。31.如权利要求30所述的方法，还包括通过将第一细胞的基因组和第二细胞的基因组进行比较来识别突变。32.如权利要求31所述的方法，其中所述第一细胞和所述第二细胞来自不同的组织。33.一种预测对象年龄的方法，包括：a.提供来自所述对象的至少一个样品，其中所述至少一个样品包含基因组；b.使用权利要求1所述的方法对基因组进行测序以识别突变；c.将步骤b中获得的突变与标准参考曲线进行比较，其中所述标准参考曲线将突变计数和位置与验证的年龄相关联；以及d.基于与所述标准参考曲线的突变比较来预测所述对象的年龄。34.如权利要求33所述的方法，其中所述标准参考曲线针对对象的性别是特异性的。35.如权利要求33所述的方法，其中所述标准参考曲线针对对象的种族是特异性的。36.如权利要求33所述的方法，其中所述标准参考曲线针对对象的地理位置是特异性
的，所述对象在所述地理位置度过了其生命中的一段时期。37.如权利要求33所述的方法，其中所述对象小于15岁。38.如权利要求33所述的方法，其中所述至少一个样品大于1000年。39.如权利要求33所述的方法，其中对至少5个样品进行测序。40.如权利要求39所述的方法，其中所述至少五个样品来自不同的组织。41.一种用于对微生物或病毒基因组进行测序的方法，包括：a.获得包含一种或多种基因组或基因组片段的样品；b.使用权利要求1所述的方法对所述样品进行测序，以获得多个测序读取；以及c.对所述测序读取进行组装和分选，以生成所述微生物或病毒基因组。42.如权利要求41所述的方法，其中所述样品包含来自至少十种生物体的基因组。43.如权利要求41所述的方法，其中所述样品包含来自至少100种生物体的基因组。44.如权利要求41所述的方法，其中所述样品来源是包括深海喷口、海洋、矿井、溪流、湖泊、陨石、冰川或火山的环境。45.如权利要求41所述的方法，还包括识别所述微生物基因组中的至少一种基因。46.如权利要求41所述的方法，其中所述微生物基因组对应于未培养的生物体。47.如权利要求46所述的方法，其中所述微生物基因组对应于共生生物体。48.如权利要求41所述的方法，还包括在重组宿主生物体中克隆至少一种基因。
技术总结
本文提供了用于准确和可扩展的原代模板定向扩增(PTA)核酸扩增和测序方法的组合物和方法，以及它们在研究、诊断和治疗中用于突变分析的应用。这样的方法和组合物有利于靶(或“模板”)核酸的高度精确扩增，从而提高下游应用(诸如下一代测序)的准确性和灵敏度。用(诸如下一代测序)的准确性和灵敏度。用(诸如下一代测序)的准确性和灵敏度。
技术研发人员：杰伊
受保护的技术使用者：圣祖德儿童研究医院
技术研发日：2020.07.30
技术公布日：2022/5/10