大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和在生产丙酮酸中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物基因工程技术领域，具体地，本发明涉及一种大肠杆菌基因工 程菌及其构建方法和在生产丙酮酸中的应用。
【背景技术】
[0002] 丙酮酸（Pyruvic acid)，浅黄色至黄色透明液体，是生物体基本代谢中间产物之 一，广泛应用于食品添加剂、农药、医药等领域。可作为前体，酶法合成L-色氨酸、L-酪氨 酸、D-/L-丙氨酸和L-二羟基苯丙氨酸等，同时在减肥、增强耐力、降低胆固醇等人类健康 领域有应用潜力。目前，丙酮酸的合成主要采用化学法，由酒石酸和焦硫酸钾反应获得。由 于原料转化率低、反应条件苛刻，总成本较高。与之相比，发酵法生产丙酮酸具有原料成本 低、来源广、产物纯度高、反应条件温和等诸多优势，更具有市场竞争力。
[0003] 发酵法生产丙酮酸的研宄开始于二十世纪90年代，日本、美国等发达国家在菌株 选育、工程菌株构建等方面积累了大量的经验，尤其日本，已经实现了产业化，处于世界领 先水平。我国的相关研宄主要由江南大学和中国科学院微生物研宄所所属的两个课题组开 展，也取得了不错的进展。
[0004] 发酵菌株的选育和构建一直是丙酮酸产业化的关键。在微生物代谢体系中，丙酮 酸是糖酵解途径的终产物，处于糖类、脂类、蛋白质三种主要物质代谢的中心位置，具有重 要的枢纽性作用，存在多条丙酮酸降解途径，无论厌氧和好氧条件下，丙酮酸都难以大量积 累。在好氧条件下，丙酮酸会在丙酮酸脱氢酶系的作用下降解为乙酰辅酶A和CO 2，乙酰辅 酶A进入TCA循环、乙酸合成途径和脂肪酸合成途径等，最终产物主要为菌体、CO2和乙酸 等；而在厌氧环境下，丙酮酸会在乳酸脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶的作用下，产生乳酸、甲酸 和乙酰辅酶A，乙酰辅酶A会进入乙酸合成途径，最终实现混合酸发酵。
[0005] 阻断和减弱丙酮酸的降解途径是实现丙酮酸积累的主要思路。目前发酵菌 株研宄最多的是光滑球拟酵母（Torulopsis glabuata)和大肠杆菌（Escherichia coli)基因工程菌。日本的Yonehara等筛选出一株多种维生素营养缺陷型光 滑球拟酵母T. glabuata IFO 005,经过诱变后，丙酮酸得率可达到0. 52-0. 54g/ g[JP，patent2000078996]。采用分批补料方式培养63小时，丙酮酸浓度达到67. 8g/L[J. Ferment. Bioeng.，1996, 82 (5) :475-479]。刘立民等在高浓度NaCl溶液中驯化得到一株 高盐耐受菌株T. glabuata RS23,培养82小时，丙酮酸浓度可达到94. 3g/L，葡萄糖转化 率达到 0· 635g/g[Biotech. Bioeng.，2007,97(4) :825-832]。与采用筛选、驯化手段改造 酵母相比，产丙酮酸大肠杆菌构建主要采用基因工程技术，通过使丙酮酸降解途径失活来 实现。Ingram 等以 E.coli W3110 为出发菌株，通过敲除 ldhA、poxB、ackA、pflB、adhE、 frdBC、sucAB、atpHl基因，在阻断乙酸合成，减弱TCA代谢流的同时，增强糖酵解途径的 代谢强度，实现菌体生物量和CO 2产生量降低，积累丙酮酸达到66g/L，转化率和生产强度 分别达到 〇· 75g/g、L 2g/Lh[PNAS, 2004, 101 (8)，2235-2240]。Eiteman 等采用类似的思 路，通过敲除aceEF、pfl、poxB、pps、ldhA、atpFH、arcA基因，批次补料培养44h，丙酮酸 浓度达到90g/L，转化率和生产强度分别达到0· 68g/g、2. lg/Lh[Appl. Environ. Microbi ol.，2008, 74(21)，6649-6655]。
[0006] 虽然目前丙酮酸生产菌株的筛选和构建已经取得了很大的进展，但仍存在不足。 如，维生素营养缺陷型光滑球拟酵母普遍存在糖酸转化率不高的问题。而大肠杆菌工程菌 由于敲除了丙酮酸脱氢酶亚基或乙酸途径的编码基因，使其不能直接利用简单培养基，需 要添加维生素或是乙酸等，增加了发酵过程的控制难度及发酵成本。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的是提供一种大肠埃希氏菌（Escherichia coli)基因工程菌 YPOl，该菌保藏日期为2015年4月7日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄 所，邮编100101)保藏，其分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，其保藏号为CGMCC No.10691。
[0008] 本发明的另一个目的在于，提供一种上述大肠杆菌基因工程菌的构建方法，所述 构建方法包括以下步骤：
[0009] 在出发大肠杆菌中抑制酯酰辅酶A硫酯酶III (fadM)、酯酰辅酶A硫酯酶 II (tesB)的活性，得到重组大肠杆菌，记作重组大肠杆菌I。
[0010] 进一步地，所述方法还包括以下步骤：
[0011] 所述重组大肠杆菌I中抑制乙酸激酶（ackA)、乙酰磷酸化酶（Pta)的活性，得到 重组大肠杆菌，记作重组大肠杆菌II。
[0012] 更进一步地，所述方法还包括以下步骤：
[0013] 所述重组大肠杆菌II中抑制丙酮酸氧化酶（PoxB)的活性，得到重组大肠杆菌，记 作重组大肠杆菌III，即大肠杆菌基因工程菌YP01。保存时间：2015年4月7日，保存单位： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏号：10691。
[0014] 所述抑制硫酯酶的活性是使所述酯酰辅酶A硫酯酶III编码基因的功能丧失；所 述使所述酯酰辅酶A硫酯酶III编码基因的功能丧失的方法包括以下步骤：向所述出发大 肠杆菌中导入序列表中SEQ ID NO :1所示DNA，得到重组大肠杆菌α ;所述序列表中SEQ ID NO :1所示DNA与所述出发大肠杆菌中的酯酰辅酶A硫酯酶III编码基因发生同源重组；
[0015] 所述抑制硫酯酶的活性还包括使所述酯酰辅酶A硫酯酶II编码基因的功能丧失； 所述使所述酯酰辅酶A硫酯酶II编码基因的功能丧失的方法包括以下步骤：向所述重组大 肠杆菌α中导入序列表中SEQ ID NO :2所示DNA，得到重组大肠杆菌I ;所述序列表中SEQ ID NO :2所示DNA与所述出发大肠杆菌中的酯酰辅酶A硫酯酶II编码基因发生同源重组；
[0016] 所述抑制乙酸激酶和乙酰磷酸化酶的活性是使所述乙酸激酶和乙酰磷酸化酶编 码基因的功能丧失；所述使所述乙酸激酶和乙酰磷酸化酶编码基因的功能丧失的方法包括 以下步骤：向所述重组大肠杆菌I中导入序列表中SEQ ID NO :3所示DNA，得到重组大肠杆 菌II ;所述序列表中SEQ ID NO :3所示DNA与所述出发大肠杆菌中的乙酸激酶和乙酰磷酸 化酶编码基因发生同源重组；
[0017] 所述抑制丙酮酸氧化酶的活性是使所述丙酮酸氧化酶编码基因的功能丧失；所述 使所述丙酮酸氧化酶编码基因的功能丧失的方法包括以下步骤：向所述重组大肠杆菌II中 导入序列表中SEQ ID NO :4所示DNA，得到重组大肠杆菌III ;所述序列表中SEQ ID NO :4 所示DNA与所述出发大肠杆菌中的丙酮酸氧化酶编码基因发生同源重组；
[0018] 所述硫酯酶编码基因为酯酰辅酶A硫酯酶III编码基因和（或）酯酰辅酶A硫酯 酶II编码基因。
[0019] 所述出发大肠杆菌为大肠杆菌K-12MG1655。
[0020] 由上述方法构建得到的重组大肠杆菌也属于本发明的保护范围。
[0021] 所述大肠杆菌基因工程菌YPOl在生产丙酮酸中的应用也属于本发明的保护范 围。
[0022] 本发明的又一个目的是提供一种生产丙酮酸的方法。
[0023] 本发明提供的生产丙酮酸的方法，包括以下步骤：发酵所述大肠杆菌重组基因工 程菌YPOl或所述重组大肠杆菌，在发酵过程中通入空气或含氧气气体，消耗葡萄糖或碳 源，生产得到丙酮酸，其中，
[0024] 所述发酵温度为25°C -40°C ;
[0025] 所述发酵体系的pH值为6· 0-8. 0 ;
[0026] 所述发酵时间为16小时-96小时；
[0027] 所述发酵体系的DO值为10-40 % ;
[0028] 所述发酵接种量的体积百分比为0. 01 % -10% ;
[0029] 所述发酵培养基中的碳源可以是下述的一种或几种：葡萄糖、木糖、淀粉；
[0030] 所述发酵培养基中的氮源可以是下述的一种或几种：酵母膏、蛋白胨、玉米浆、糖 蜜、氨水、按盐、尿素。
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