AAAAAACGTCAGGGAGCCATAGATCAA AGGGAAAACTGTCCATATGC
[0071] 扩增体系和PCR程序同实例1，得到含有ackA-pta-F/ackA-pta-R和cat-sacB序 列的DNA片段，记作DNA片段III，序列表中SEQ ID NO :3。
[0072] 第二步，DNA片段III用于第一轮重组。将DNA片段III电转至重组大肠杆菌I。 电转条件为：首先准备重组大肠杆菌I的电转化感受态细胞；将50 μ 1感受态细胞置于冰 上，加入50ng DNA片段III，冰上放置2分钟，转移至0. 2em的Bio-Rad电击杯，电击参数为 2. 5kv。电击后迅速将Iml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，200rpm， 30°C孵育2小时。取200 μ 1菌液涂在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，过夜培养后， 挑选5个单菌落进行PCR验证。挑选一个正确的单菌落，将其命名为重组大肠杆菌D。
[0073] 第三步，重组大肠杆菌D的自身同源重组，删除cat-sacB基因片段。具体操作为： 将重组大肠杆菌D活化于LB液体培养基，过夜培养；取ImL培养物接种于IOmL含有蔗糖的 LB液体培养基，过夜培养；取一环菌液划线培养于LB固体培养基，过夜培养；每个菌株挑取 400个单克隆点对点划线于含有氯霉素和不含氯霉素的固体培养基，过夜培养；PCR检测失 去氯霉素抗性的菌落，测定序列验证正确的即为大肠杆菌基因工程菌II。
[0074] 实施例3、如图1所示，大肠杆菌基因工程菌III的构建
[0075] 敲除大肠杆菌基因工程菌II的丙酮酸氧化酶（poxB)，构建大肠杆菌基因工程菌 III0
[0076] 如图2所示，基因敲除采用两步同源重组的方法。
[0077] 第一步，NCBI数据库中查到poxB基因的NDA序列，以此为依据设计引物poxB-F/ poxB-R，其中 poxB-F 中包括 poxB 上游 50bp、poxB 下游 50bp 及 cat-sacB 的上游 25bp， poxB-R包括poxB下游50bp及cat-sacB的下游25bp，以质粒p EASY-cat-sacB为模版进 行PCR扩增。引物序列为：
[0078] poxB-F (SEQ ID NO ：11)：
[0079] TATGCCCGATGATATTCCTTTCATCGGGCTATTTAACCGTTAGTGCCTCCAAAGGGTGGCATTTCCCGT CATAATAAGGACATGCCATGATTGATTTACGGTGACGGAAGATCACTTCGCAG
[0080] poxB-R (SEQ ID NO ：12)：
[0081] CGTAAATCAATCATGGCATGTCCTTATTATGACGGGAAATGCCACCCTTTATC AAAGGGAAAACTGTCCATATGC
[0082] 扩增体系和PCR程序同实例1，得到含有poxB-F/poxB-R和cat-sacB序列的DNA 片段，记作DNA片段IV，序列表中SEQ ID NO :4。
[0083] 第二步，DNA片段IV用于第一轮重组。将DNA片段IV电转至重组大肠杆菌II。电转 条件为：首先准备重组大肠杆菌II的电转化感受态细胞；将50 μ 1感受态细胞置于冰上，加 入50ng DNA片段IV，冰上放置2分钟，转移至0. 2em的Bio-Rad电击杯，电击参数为2. 5kv。 电击后迅速将Iml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，200rpm，30 °C孵育 2小时。取200 μ 1菌液涂在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个 单菌落进行PCR验证。挑选一个正确的单菌落，将其命名为重组大肠杆菌E。
[0084] 第三步，重组大肠杆菌E的自身同源重组，删除cat-sacB基因片段。具体操作为： 将重组大肠杆菌E活化于LB液体培养基，过夜培养；取ImL培养物接种于IOmL含有蔗糖的 LB液体培养基，过夜培养；取一环菌液划线培养于LB固体培养基，过夜培养；每个菌株挑取 400个单克隆点对点划线于含有氯霉素和不含氯霉素的固体培养基，过夜培养；PCR检测失 去氯霉素抗性的菌落，测定序列验证正确的即为大肠杆菌基因工程菌III。
[0085] 实施例4、用大肠杆菌基因工程菌YPOl生产丙酮酸
[0086] 种子培养基和发酵培养基含以下成分（除葡萄糖外）：
[0087] 大量元素（mmol/L) : (NH4) 2ΗΡ0419· 92, NH4H2POJ. 56, KCl 2. 00, MgSO4 · 7Η201· 50 ;
[0088] 微量元素（μπιο?/l) :FeCl3 · 6Η20 8· 88, CoCl2 · 6H20 I. 26, CuCl2 · 2Η20 0· 88， ZnCl22. 20, Na2MoO4 · 2Η20 L 24, H3BO3L 21，MnCl2 · 4Η20 2· 50 ;
[0089] 以大肠杆菌基因工程菌株YPOl生产丙酮酸，包括以下步骤：
[0090] (1)种子培养：在250ml三角瓶中种子培养基100ml，含葡萄糖1%，115°C灭菌 30min。冷却后将菌株YPOl按照1% (v/v)的接种量接种于种子培养基，在pH = 7. 0、37°C 和200rpm的条件下培养12小时得到种子液。
[0091] (2)发酵培养：5L发酵罐发酵培养基体积为2L，121°C灭菌20min，添加已高温灭菌 的葡萄糖母液，使发酵罐中葡萄糖浓度为5%。将步骤1中种子按照5% (v/v)的接种量接 种于发酵培养基，在pH = 7. 0、37°C和400rpm的条件下培养24小时，添加葡萄糖母液，使 发酵罐中葡萄糖总浓度达到10%，培养48小时后得到发酵液。
[0092] 分析方法：使用安捷伦（1200型）高效液相色谱对发酵液中的成分进行定量分析， 发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯乐公司的Aminex HPX-87H有机酸分析柱分析。 结果如图3所不。
[0093] 由图3可以看出：大肠杆菌基因工程菌株YPOl发酵48小时后，丙酮酸浓度达到 69g/L，产率达到0· 73g/g，丁二酸生产强度为I. 44g/L · h。
【主权项】
1. 一种大肠埃希氏菌基因工程菌YPOl，其保藏号为CGMCC No. 10691。2. 权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌YPOl的构建方法，所述方法包括以下步骤： 采用同源重组技术，敲除大肠杆菌K-12MG1655中的酯酰辅酶A硫酯酶III基因、酯酰 辅酶A硫酯酶II基因，命名为重组大肠杆菌I。3. 根据权利要求2所述大肠杆菌基因工程菌YPOl的构建方法，其特征在于，所述方法 还包括以下步骤： 采用同源重组技术，敲除重组大肠杆菌I中的乙酸激酶基因和乙酰磷酸化酶基因，命 名为重组大肠杆菌II。4. 根据权利要求3所述大肠杆菌基因工程菌YPOl的构建方法，其特征在于，所述方法 还包括以下步骤： 采用同源重组技术，敲除重组大肠杆菌II中的丙酮酸氧化酶，命名为重组大肠杆菌 III，即大肠杆菌基因工程菌YPO1。5. 权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌YPOl在生产丙酮酸中的应用。6. -种生产丙酮酸的方法，发酵权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌YP01，得到丙 酮酸。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在发酵过程中通入空气或含氧气气体，消 耗葡萄糖或碳源，生产丙酮酸，其中： 发酵温度为25°C -40°C ; 发酵体系的pH值为6. 0-8.0 ; 发酵时间为16小时-96小时； 发酵接种量的体积百分比为〇. 01% _1〇% ; 发酵培养基中的碳源是葡萄糖、木糖和淀粉中的一种或几种； 发酵培养基中的氮源是酵母膏、蛋白胨、玉米浆、糖蜜、氨水、铵盐和尿素中的一种或几 种。
【专利摘要】本发明公开了一种大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和应用。本发明所提供的基因工程菌是按照包括以下步骤的方法构建的：在出发大肠杆菌中降低或抑制硫脂酶活性，失活乙酸合成途径，构建得到大肠杆菌基因工程菌YP01。本发明所构建的大肠杆菌基因工程菌菌株YP01，在好氧条件下，利用无机盐培养基发酵48小时，可将95g/L葡萄糖转化生成69g/L丙酮酸，适合工业化生产。CGMCC No.1069120150407
【IPC分类】C12N15/90, C12P7/40, C12N1/21
【公开号】CN104946576
【申请号】CN201510205724
【发明人】杨茂华, 邢建民, 刘谊兰, 白冰
【申请人】中国科学院过程工程研究所
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年4月27日