7] 作为优选，进一步，在第二步猪胎儿成纤维细胞转染、筛选过程中，在第3)步中再 次复苏细胞时，加入30ugleptin过量表达载体pLeptin-IRES2-AcGFPl后，移入电击杯中， 按照如下参数进行转染：方波，电压250V，电击时间20ms，电击次数1次，电击间隔时间0s， 电击杯厚度4mm。
[0048] 作为优选，进一步，在第三步L印tin细胞的核移植及胚胎移植中，进行受体卵母 细胞的培养时，挑选直径为3-6mm的卵泡从中抽取卵丘-卵母细胞复合体，放入添加0.lmg.ml1丙酮酸、0.lmg.ml 半胱氨酸盐酸、10%猪卵泡液、10ng.mLtGF的TCM-199成熟培养 液滴中，在5%C02,38. 5°C的培养箱中培养38-42h。
[0049] 作为优选，进一步，在第三步L印tin细胞的核移植及胚胎移植中，进行电融合和 电激活重构胚时，，电融合参数为：25V/mm脉冲电压，脉冲时程20 μ s，脉冲次数1次；电激 活参数为：150V/mm脉冲电压，脉冲时程100ys，脉冲次数1次，重构胚再移入含2. 2ug. mL 的培养液中后放入含有5% C02、5% 02、38. 5°C的三气培养箱中平衡培养。
[0050] 本发明的最终目的是建立克隆猪动物模型进行与L印tin基因功能相关的研究， 以研究L印tin基因的表达量为切入点，通过体外构建L印tin基因过量表达载体，利用体细 胞核移植克隆转基因技术，成功实现了L印tin基因在猪体内的过量表达，用该种方法建立 的动物模型为研究人类Leptin基因的表达调控及基因功能具有重要的参考意义。
[0051] 本发明的有益效果：
[0052] 1、本发明通过分子克隆相关技术构建出来的pL印tin-IRES2-AcGFPl真核表达载 体，具有特异地、高效地增强基因表达量的效果，实现了Leptin基因的过量表达，操作方法 简单，与传统的构建方法相比，简化了构建过程中目的基因编码蛋白系列的合成步骤；
[0053] 2、本发明的最终目的是建立克隆猪动物模型进行与L印tin基因功能相关的研 究，该发明以研究L印tin基因的表达量为切入点，通过体外构建L印tin基因过量表达载 体，利用体细胞核移植克隆转基因技术，成功实现了Leptin基因在猪体内的过量表达，用 该种方法建立的动物模型为研究人类L印tin基因的表达调控提供了重要的参考以及和应 用前景；
[0054] 3、本发明中选取猪作为L印tin基因过量表达的研究对象，而猪在体型大小、解剖 结构、生理生化上与人极为相似，这就为人类L印tin基因功能所调控的疾病研究奠定了基 础，对于由L印tin基因表达调控所建立的动物模型在人类相关疾病的治疗中的推广应用 具有重要的指导意义。
[0055] 4、本发明通过对现有的实验室技术进行创造性改进，在培养过程中实现参数进行 优化选择，可快速高效的使Leptin基因在大约克猪体内实现过量表达，最终获得过量表达 Leptin基因的克隆猪，成功率高，缩短培养周期，操作简单、可控性高，实用性强。
【附图说明】
[0056] 图1为本发明的流程图。
[0057] 图2为pL印tin-IRES2-AcGFPl表达载体的构建流程图。
[0058] 图3为转L印tin基因载体的验证图，其中1为经过EcoRI和Sail双酶切后的胶 图，2为PCR扩增后的胶图，大小均为530bp。
[0059] 图4为转L印tin基因测序鉴定图。
[0060] 图5为出生的14头转L印tin基因克隆猪基因组DNA的鉴定图。
[0061] 图6为转Leptin基因克隆猪提起RNA反转录PCR鉴定图，其中A图是以β-actin 基因作为目标进行扩增的结果，B图是以GFP基因作为目标进行扩增结果，C图是以leptin 基因作为目标进行扩增结果。
[0062] 图7为L印tin基因在肝脏、胰腺、肌肉、皮下脂肪、睾丸等组织中的表达情况。
[0063] 图8为L印tin基因在大肠、空肠、回肠、十二指肠等组织中的表达情况。
【具体实施方式】
[0064] 下面将结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整 地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本 发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实 施例，都属于本发明保护的范围。
[0065] 实施例1 :
[0066] 一种构建过量表达L印tin基因的克隆猪的方法，主要按照以下步骤进行：
[0067] 第一步、构建Leptin基因过量表达载体
[0068] 1)用PCR法扩增目的L印tin基因并对胶进行回收，并将L印tin片段连接到 pMD18_T载体上，得到重组质粒pMD18_Leptin;
[0069]2)酶切pIRES2-AcGFPl载体和pMD18-L印tin载体，利用胶回收试剂盒对 所需的片段大小进行回收，将L印tin连接到pIRES2-AcGFPl载体上，得到重组质粒 pLeptin-IRES2-AcGFPl；
[0070] 3)采用试剂盒法制备无内毒素的质粒DNA，用于细胞转染，并对 pL印tin-IRES2-AcGFPl载体进行回收和纯化，-20°C保存备用；
[0071] 第二步、猪胎儿成纤维细胞转染、筛选
[0072] 1)利用组织消化法建立猪30日龄胎儿成纤维细胞系，冻存备用；
[0073] 2)复苏冻存备用的胎儿成纤维细胞系，进行G418毒性敏感性检测，得到10天内使 细胞全部死亡的最适浓度500ng/ul ;
[0074] 3)再次复苏细胞，待细胞汇合度达到80-90 %时收集细胞并计数，将细胞用电击 缓冲液重悬，并加入30ug线性化转基因载体pL印tin-IRES2-AcGFPl，移入电击杯中进行转 染；
[0075] 4)电击完成后，将细胞悬液迅速转移到100mm培养皿中进行培养，48h后收集细胞 进行初步鉴定和极度稀释培养；
[0076] 5)根据步骤2)中得到的最适浓度500ng/ul，在极度稀释培养3天后换液，开始用 加有适当浓度G418的含有10 %FBS的DMEM完全培养基进行培养，每隔3天换一次液，10d 后能得到牛津杯大小的单克隆点；
[0077] 6)在显微镜下用记号笔画出单克隆点的位置，胰酶消化法抠出单克隆点放入48 孔板中进行培养，第二天换加有一半浓度G418的DMEM完全培养基（含10%FBS)进行培养， 每天观察细胞生长状况，将长满的细胞进行详细编号并传代至另外一个48孔板，一份用于 鉴定是否是阳性，一份用于扩大培养；
[0078] 7)待用于鉴定的细胞长满后，用胶原酶消化法收集细胞，提取基因组DNA，PCR鉴 定是否是阳性，对鉴定出来的阳性细胞系进行扩大培养和冻存备用；
[0079] 第三步、L印tin细胞的核移植及胚胎移植
[0080] 1)受体卵母细胞的培养
[0081]a、从屠宰场采集猪的卵巢并在4h内运回实验室；
[0082]b、挑选直径为3-6mm的卵泡从中抽取卵丘-卵母细胞复合体，放入TCM-199成熟 培养液滴中，在5%C02,38. 5°C的培养箱中成熟培养38-42h;
[0083] 2)构建过量表达L印tin基因的重构胚
[0084]a、取转入L印tin基因的成纤维细胞，用含有0· 5%FBS的DMEM培养48h，使体细 胞处于6。或Gi期；
[0085]b、卵丘-卵母细胞复合体经体外成熟培养后，用0. lmg. mL1透明质酸去除卵母细 胞外围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理0. 5-lh，在操作液中 用显微注射针将极体及其周围胞质一起吸去，然后将转L印tin基因的成纤维体细胞导入 到去核的卵母细胞的卵间隙中；
[0086] 3)电融合和电激活重构胚
[0087] 再将每批约20枚重构胚胎，移入融合液中清洗三遍，进行重构胚的电融合处理； 完成后移入NCSU23培养基中培养2h，再把待孤雌激活的卵母细胞在激活液中清洗三遍， 然后进行电激活，重构胚移入含有2.Sug.ml/CB的培养液中后放入含有5%C02、5%02、 38. 5°C的三气培养箱中平衡2h;